山東省局部地區(qū)番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定

摘 要:近年來山東省部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉癥狀。為了確定這種疑似病毒，利用雙生病毒外殼蛋白(CP)基因及DNA-A基因組的引物對棗莊、菏澤和淄博的染病番茄葉片進行了檢測，測序分析表明這種病毒是番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，該病毒可能是由我國東南沿海地區(qū)和日本傳入的。

關(guān)鍵詞:番茄黃化曲葉病毒;山東省;PCR

中圖分類號:S436.412⁺1(252)∶Q789 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)02-0013-04

番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)(Geminiviridae:Begomovirus)屬于煙粉虱傳染病毒，該病毒引起的番茄黃化曲葉病(TYLC)的主要癥狀是植株上部葉片黃化，葉邊緣上卷，葉片變小，植株明顯矮化。番茄黃化曲葉病導(dǎo)致番茄產(chǎn)量大幅降低甚至絕產(chǎn)。目前我國已在云南、廣西[1，2]多省份報告發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉中國病毒(TYLCCNV)，但是番茄黃化曲葉病毒首先被發(fā)現(xiàn)是在2006年的上海和浙江[3，4]。這些資料表明，番茄黃化曲葉病毒主要分布在我國的東南沿海地區(qū)。

在過去的3年中(2007～2009年)，山東省許多地區(qū)發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉癥狀。為了確定這種疑似病毒，本研究利用雙生病毒外殼蛋白(CP)基因[5]及DNA-A基因組的引物[3]對棗莊、菏澤和淄博的染病番茄葉片進行了檢測，同時根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析探討了該病毒的傳入途徑及來源。

1 材料與方法

1.1 材料采集與植物總DNA的提取

感病的病毒植株分別采自棗莊、菏澤和淄博地區(qū)，-20℃保存?zhèn)溆?。植物葉片總DNA的提取利用北京全式金生物技術(shù)有限公司植物基因組DNA提取試劑盒。提取的總DNA用1%的瓊脂糖電泳檢測后，貯備在-20℃的冰箱中備用。

1.2 外殼蛋白基因的PCR擴增與測序

1.4 序列同源性分析

將測序結(jié)果提交GenBank。對棗莊、菏澤和淄博外殼蛋白基因片段進行了BLAST初步分析。對于棗莊、淄博植株病毒DNA-A基因組序列，以中國臺灣番茄曲葉病毒(ToLCTWV)、菲律賓番茄曲葉病毒(ToLCPV)序列為外群，用Clustal W多序列對位排列程序與GenBank已知番茄黃化曲葉病毒(表1)進行對位排列，并輔以人工校對。用MEGA4.1軟件，采用Kimura 2-paramter距離矩陣、最小進化法(ME)以及鄰位法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹，系統(tǒng)樹各分支置信度(bootstrap)均進行

2 結(jié)果與分析

2.1 基于外殼蛋白(CP)基因?qū)χ参锊《境醪借b定

從棗莊、菏澤和淄博染病葉片總DNA中獲得的外殼蛋白(CP)基因在GenBank中的登錄號分別為FJ939638、FJ939639、GQ352539，BLAST分析證實它們與番茄黃化曲葉病毒相關(guān)性大于95%。

2.2 基于DNA-A基因組進行系統(tǒng)發(fā)育分析

棗莊、淄博植株病毒DNA-A的完整基因組在GenBank的登錄號分別為GQ352538、GQ352537。系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)表明，所有番茄黃化曲葉病毒均為一支。我國番茄黃化曲葉病毒主要分布于2個分支中。一個分支是由本研究中發(fā)現(xiàn)的病毒(GQ352538、GQ352537)、浙江(AM698117、AM698118)、上海(AM282874)、山東(FN256257)、日本(AB192965、AB192966)[6]番茄黃化曲葉病毒組成;另一支由上海(EU031444)、浙江(AM698119)、江蘇(FN256259)、日本(AB363566)、美國(EF539831)和墨西哥(EF210555)番茄黃化曲葉病毒組成。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，在山東省各地發(fā)現(xiàn)的番茄疑似病毒病是由番茄黃化曲葉病毒導(dǎo)致。這表明，該病毒在過去幾年內(nèi)在我國不斷擴散。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，山東省的番茄黃化曲葉病毒與鄰省江蘇的番茄黃化曲葉病毒并沒有聚為一支，而與東南沿?；蛉毡镜姆腰S化曲葉病毒聚為一支，這表明山東省的番茄黃化曲葉病毒可能是從我國東南沿?；驈娜毡緮U散進入，而不是由鄰近的江蘇省傳入。

近年來，我國煙粉虱的生物型正在發(fā)生著變化。例如，近年來山東省煙粉虱的優(yōu)勢生物型由B型逐漸變?yōu)榱薗型[12]。且煙粉虱在山東省發(fā)生范圍廣[7]，某些地區(qū)種群數(shù)量大[8]，對當?shù)刈魑?、蔬菜等造成嚴重損失[9～11]。這種生物型的變化是否與番茄黃化曲葉病毒的傳入相關(guān)有待于進一步的研究。

參 考 文 獻:

[1] Yin Q Y，Hong Y G，Tian P，et.al.Tomato yellow leaf curl China virus:monopartite genome organization and agroinfection of plants[J].Virus Research，2001，81:69-76.

[2] Xie Y，Zhou X P，Li X G.Molecular characterization of Tomato yellow leaf curl China virus and its satellite DNA isolated from tobacco[J].Chinese Sciences Bulletin，2003，48:593-597.

[3] Wu J B，Dai F M，Zhou X P.First report of tomato yellow leaf curl virus in China[J].Plant Disease，2006，90:1359.

[4] Mugiira R B，Liu S S，Zhou X.Tomato yellow leaf curl virus and tomato leaf curl Taiwan virus invade Southeast coast of China[J].Journal of Phytopathology，2008，156(4):217-221.

[5] Wyatt S D，Brown J K.Detection of subgroup Ⅲ geminivirus isolates in leaf extracts by degenerate primers and polymerase chain reaction[J].Phytopathology，1996，86(12):1288-1293.

[6] Ueda S，Takeuchi S，Iwanami T.Evidence of a new tomato yellow leaf curl virus in Japan and its detection using PCR[J].Genetic Plant Pathology，2005，71:319-325.

[7] 褚 棟，周洪旭，王 斌，等.山東省煙粉虱與溫室白粉虱種群動態(tài)及其地理分布調(diào)查[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，2:64-66.

[8] 劉國霞，禇 棟，陶云荔.山東省煙粉虱地理分布及部分地區(qū)種群動態(tài)調(diào)查[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40(2):205-208.

[9] 姜 濤，褚 棟，姜德鋒，等.轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因棉對煙粉虱種群動態(tài)影響及其幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性變化[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，9:42-47.

[10]姜 濤，褚 棟，姜德鋒，等.煙粉虱刺吸誘導(dǎo)轉(zhuǎn)Bt+CpTI基因棉苯丙氨酸解氨酶和氧保護酶系活性變化[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，10:48-53.

[11]姜 濤，姜德鋒，褚 棟，等.轉(zhuǎn)CrylAc+CpTI雙價基因棉對煙粉虱主要解毒酶活性的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，9:69-72.

[12]Chu D，Jiang T，Liu G X，et al.Biotype status and distribution of Bemisia tabaci(Hemiptera: Aleyrodidae)in Shandong Province of China based on mitochondrial DNA markers[J].Environmental Entomology，2007，36:1290-1295.