洋蔥二氫黃酮醇-4-還原酶基因的分子克隆

摘 要:鱗莖的皮色是洋蔥的重要經濟性狀之一。洋蔥的二氫黃酮醇-4-還原酶基因AcDFR1的開放閱讀框為1 158 bp，編碼385個氨基酸殘基;具有5個內含子，均符合GT-AG規則。本研究為闡明洋蔥皮色形成的分子機制以及開發

分子標記奠定了基礎。

關鍵詞:二氫黃酮醇-4-還原酶基因;基因克隆;序列分析;洋蔥

中圖分類號:S633.22∶Q785 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)02-0008-05

百合科蔥屬蔬菜是類黃酮含量較高的蔬菜種類之一。類黃酮是一類供氫型自由基清除劑，具有廣泛的生物活性和重要的藥用價值，對人體健康有重要影響。在防治心腦血管疾病、保肝護肝、抗腫瘤、抗自由基、抗氧化、抗雌激素缺乏、抗消化性潰瘍、抗過敏、消炎、抗病毒、鎮痛、止咳、平喘等方面有重要作用[1，2]。

洋蔥(Allium cepa L.)是百合科蔥屬二年生草本植物，是世界上重要的蔬菜作物。洋蔥不僅可以鮮食，還是很好的加工原料，已成為我國主要的出口創匯蔬菜之一。洋蔥以肥大的肉質鱗莖為食用器官，根據其鱗莖的皮色可分為紅皮、黃皮和白皮等品種。皮色是洋蔥的重要經濟性狀之一，其遺傳規律已經被揭示[3，4];但其分子機制仍不十分清楚，相關的結構基因和調控基因有待進一步的克隆和研究。

花青素的生物合成前體為丙二酰CoA 和對香豆酰CoA，由苯基乙烯酮合成酶(CHS)催化二者形成苯基乙烯酮。黃色苯基乙烯酮異構化形成無色的黃烷酮。在黃烷酮羥基化酶(F3H)催化下形成無色的二羥基黃酮醇，由二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)催化還原形成無色花色素，無色花色素在花青素合酶作用下轉變成有色花色素。然后由UF3GT (UDP- 葡萄糖類黃酮-3- 氧- 葡萄糖轉移酶)催化，糖基化形成花青素[5，6]。從二氫黃酮醇轉變成花青苷的反應非常復雜， DFR 是這一轉變中起作用的第一個酶，失去DFR 活性的突變體產生象牙色或者白色。由于不同物種的DFR對底物的選擇性不同，所以合成不同的花色素，呈現各異的顏色。DFR基因是Reilly 等采用轉座子標簽法首先從玉米和金魚草中分離出來的[7]。后來從許多其它物種(如擬南芥、小麥、金蕎麥和甘薯等)中相繼克隆出來[8～11]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以洋蔥的新鮮葉片和花為材料，采自山東省農業科學院蔬菜研究所試驗基地，取樣后迅速放入液氮中冷凍，于-80℃保存備用。

1.2 DNA、RNA提取

基因組總DNA用植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，用pH 8.0 的TE 稀釋成50 ng/μl。總RNA用RNAsimple總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取，cDNA 第一鏈的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen，北京)完成。

1.3 PCR反應

本研究所用的上游引物P1: CAACGCCAACTTAGAAGAAAGAAC和下游引物P2: GACACAGGGAATAGGGAAATTGG由博尚生物技術有限公司合成。

PCR反應總體積為25 μl，其中模板(基因組總DNA或者cDNA)1 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2 μl，引物各0.5 μl，10×Ex-Taq buffer 2.5 μl，Ex-Taq DNA polymerase(Takara，大連)0.13μl，用滅菌蒸餾水補充至25 μl。

擴增程序:94℃預變性3 min;94℃變性30 s，57℃退火 1 min，72℃延伸2 min，35個循環;最后72℃保溫8 min。

1.4 目的片段的克隆

擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，然后在Fluor Chem TM 5500凝膠成像系統(Alpha Innotech， USA)上檢測并照相記錄，分子量Marker DL2000從大到小依次為:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 擴增產物用凝膠回收試劑盒(Tiangen，北京)進行回收，與克隆載體pMD18-T(Takara，大連)連接，轉化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5感受態細胞，經藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆送到博尚生物技術有限公司進行測序。

1.5 序列分析

序列比對通過Blast(http://www.ncbi.

nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)進行。生物信息學分析主要采用DNAMAN 軟件及http://www.expasy.org 、http://www.softberry.com等鏈接的網上軟件進行。

2 結果與分析

2.1 洋蔥AcDFR1基因的克隆

洋蔥總DNA擴增的PCR 產物和RT-PCR 產物經電泳分離(圖1)。再通過回收、連接、轉化后，經藍白斑篩選和PCR鑒定，將陽性克隆進行序列測定。測序結果顯示總DNA擴增片段1 709 bp，RT-PCR 產物11 289 bp，將其序列進行ORF分析，發現有完整的開放讀碼框。其ORF序列1 158 bp，預測的蛋白質由385個氨基酸殘基組成，將其命名為AcDFR1基因。

2.2 洋蔥AcDFR1基因的序列特征

將AcDFR1基因的基因組序列和cDNA序列進行比對，發現其編碼區有6個外顯子和5個內含子(圖2)。這些內含子都符合GT-AG規則，即其5′端為GT核苷酸殘基、3′端為AG核苷酸殘基。

擬南芥的DFR基因也有6個外顯子和5個內含子，將二者相對應的外顯子和內含子分別做序列比對，結果(圖3)顯示的序列相似性:外顯子依次為48.53%、62.35%、69.74%、68.75%、61.86%和42.63%;內含子依次為40.86%、33.64%、42.31%、44.44%和41.49%。可見，外顯子的相似性明顯高于內含子，說明內含子序列為非編碼區，受自然選擇的壓力小，變異較大、較快。

2.3 洋蔥AcDFR1基因編碼蛋白的特征

將洋蔥AcDFR1基因預測的編碼蛋白與模式植物水稻和擬南芥的DFR蛋白進行序列相似性比較，結果(圖4)顯示它們的部分區域很保守，這些區域可能與它們的功能發揮有重要作用。其N端存在一個NADP 結合位點VTGAS(G)GF(Y)VGSWLVMK(R)LLHYGY，而C端的差異較大。

用Signal P 3.0 Server 檢測，結果顯示AcDFR1不含信號肽序列，為非分泌蛋白。采用SOPMA 進行二級結構預測，結果表明AcDFR1 蛋白二級結構主要由α-螺旋(Alpha helix，39.74%)、少量的延伸鏈(extend strand，16.36%)、β-轉角(Beta turn，6.75%)和隨機卷曲(Random coil，37.14%)組成。

2.4 DFR編碼蛋白的進化樹分析

將洋蔥的DFR基因與水稻(Oryza sativa)、小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、鹿子百合(Lilium speciosum)、郁金香(Tulipa gesneriana)、早花百子蓮(Agapanthus praecox)、荷蘭鳶尾(Iris hollandica)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、圓葉牽牛(Ipomoea purpurea)、裂葉牽牛(Ipomoea nil)、甘薯(Ipomoea batatas)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、煙草(Nicotiana tabacum)等的二氫黃酮醇-4-還原酶進行聚類分析。結果(圖5)單子葉植物和雙子葉植物各聚成一個大類。洋蔥與早花百子蓮、鹿子百合、郁金香等其它百合科植物聚成一類;同時與禾本科的水稻、小麥、大麥、玉米和高粱聚成一大類。這就提示我們，在今后的洋蔥研究工作中，可以借鑒其它單子葉植物的相關信息，同時參考雙子葉模式植物。

3 討論與結論

核酸序列和蛋白質序列的分析結果表明，我們已從洋蔥中成功克隆了AcDFR1基因的全長gDNA和cDNA序列。其ORF序列1 158 bp，預測的蛋白質由385個氨基酸殘基組成。將AcDFR1基因的基因組序列和cDNA序列進行比對，發現其編碼區有6個外顯子和5個內含子。根據GenBank上登錄的資料，擬南芥、金魚草與矮牽牛的DFR基因序列也都包含6 個外顯子，5 個內含子;這些內含子剪切位點都符合真核生物典型的GT-AG 規則。

DFR基因是控制花色素苷和原花色素生物合成分支途徑的關鍵酶基因，其分子特征和調控已在很多植物中得到深入研究。擬南芥中位于tt3 位點的DFR結構基因突變，使得種子表皮中缺乏花色素的積累，導致tt(transparent testa，透明的種皮)表現型[8]。矮牽牛細胞中由于缺少將二氫三羥黃酮醇轉化為無色天竺葵青素苷的DFR酶，缺少天竺葵青素苷，從而導致矮牽牛中缺少橘紅、磚紅和亮紅色的品種。Meyer等[12]將玉米的DFR基因轉入矮牽牛變異株RL01株系(花呈白色)，獲得的轉基因株開出的花呈紅色。Petit等[13]首次對DFR的三維結構進行了詳細描述，進一步證實了其NADP結構域和底物特異結合位點的存在。

此次試驗成功克隆了洋蔥的DFR基因，為洋蔥花青素合成代謝及調控途徑的研究奠定了基礎。隨著洋蔥類黃酮生物合成途徑的相關基因逐步被揭示，我們將從這些基因的內含子和啟動子序列的多態性中開發皮色相關的分子標記，并把這些標記應用于洋蔥的雜交育種實踐中，建立具有自主知識產權的洋蔥雜交育種體系。

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