不同微生物菌劑降解土殘農藥的研究

摘要：為證實微生物菌對土殘農藥有較好的降解作用，進行了一系列實驗室和大田土壤的農藥降解試驗。結果表明，水解試驗中，EM菌和枯草芽孢桿菌對辛硫磷、丙溴磷降解比較明顯；枯草芽孢桿菌對土壤中受試農藥甲基對硫磷具有較強的降解能力，同時對枯草芽孢桿菌降解土殘農藥的用量做了初步研究。

關鍵詞：微生物菌劑；EM菌；枯草芽孢桿菌；土殘農藥；降解

中圖分類號：X592 文獻標識號：A 文章編號：1001－4942(2010)04－0075－04

化學農藥以其見效快、防治譜廣、性質穩定、便于貯運、價格低廉等優點，在防治農作物病蟲草害及消滅衛生害蟲、疾病等方面發揮著巨大作用，促進了現代農業的發展。有機磷農藥在我國應用較為廣泛，2005年，我國農藥總產量為103.9×104 t，其中有機磷農藥產品占總量的70％。但是，大量使用農藥也帶來了環境污染、殺傷天敵和病蟲草害產生抗藥性等副作用，導致了農藥殘留(以下簡稱農殘)增加、地力減退及農產品品質下降等不良后果，特別是毒性大、性質穩定的農藥農殘期長且不易降解，給人類健康帶來了嚴重威脅。我國土壤的農藥污染問題日益突出，土壤環境安全和農產品安全已成為人們關注的熱點問題。對土壤的農藥污染可進行物理、化學和生物修復，微生物以其生長繁殖速度快、代謝類型多、能降解多種農藥進行生長的特點而逐漸成為化學農藥的克星。微生物的降解作用是對土壤中農藥最主要也是最徹底的凈化。微生物對土壤中農藥的降解反應較多，也很復雜，其中比較重要的微生物降解反應有氧化、還原、水解、開環作用等。而對農藥有降解能力的微生物有細菌、放線菌、真菌等。因此我們利用微生物對農藥的降解作用進行了治理土壤農藥污染的試驗。利用生物本身或生物產品來降解污染物的生物修復方法具有無毒、無殘留等優點，是消除農藥殘留或者降低殘留農藥毒性的一種相對廉價而有效的方法，微生物菌劑做肥料施用時不同程度地表現出對作物病蟲害的抑制作用。利用枯草芽孢桿菌降解土壤中農藥技術研究具有十分重要的意義。本試驗為進一步探索受農藥污染土壤的生物修復技術提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌種與菌劑

供試菌種為人工分離篩選培養的枯草芽孢桿菌和EM菌，由曹州農化公司和臺灣百泰生物科技有限公司提供。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Y1336作為一種復合生物菌劑，含有多種從土壤中篩選出來能促進作物生長并抑制病原菌繁殖的菌種，不僅為作物提供養分以促進作物生長，還能產生拮抗物質以抑制土壤有害病原微生物的繁殖，收到很好的土壤生物污染防治效果。EM菌種由雙歧菌、乳酸菌、芽孢桿菌、光合細菌、酵母菌、放線菌、醋酸菌等單一菌種經特殊工藝研制而成的高效復合微生物菌種。以上兩個菌種每克含有益總菌數≥100×10個。

微生物降解有機磷農藥的作用方式可分為兩大類，一是微生物直接作用于有機磷農藥，通過酶促反應降解農藥，常說的微生物降解有機磷農藥多屬于此類；二是通過微生物的活動改變了化學和物理的環境而間接作用于有機磷農藥，一般有礦化作用、共代謝作用、生物濃縮或累積作用及其它的間接作用等。

1.2 試驗土壤

試驗地選在菏澤市牡丹區李丁樓村，土壤為壤質潮土，pH值為7.4，土壤有機質含量為11.5g/kg。試驗用的土壤樣品為經風干過10目篩的土壤。

1.3 樣品中農藥殘留測定

試驗用農藥為辛硫磷、丙溴磷、甲基對硫磷。樣品中農藥殘留測定采用高效液相色譜法。

儀器：具UV-254 nm檢測器。

色譜柱：150 mill×4，6 r/lr/l(id)不銹鋼柱，內裝Zorbax C18填充物，5 μm；色譜數據處理機。

高效液相色譜操作條件：流動相為甲醇+水=75+25(V/V)；流量1.0 ml/min；柱溫為室溫；檢測波長254 nm；進樣量10μl；辛硫磷的保留時間3.865 min，丙溴磷的保留時間7.948 min，甲基對硫磷的保留時間6.328 min。

2 結果與分析

2.1 菌劑對水體中農藥的降解效果

兩種農藥分別設3個處理，對照均為純凈水，處理1加入EM菌1g/kg，處理2加入枯草芽孢桿菌1g/kg，試驗前辛硫磷濃度均為1024 mg/kg、丙溴磷1023 mg/kg，加入菌劑20天后，分別測各處理農藥濃度，結果見表1。

試驗結果表明，辛硫磷、丙溴磷在水體(CK)中降解非常緩慢，20天后濃度變化很小，濃度分別下降3 mg/kg和5 mg/kg，而加入枯草芽孢桿菌和EM菌的樣品，農藥濃度顯著降低，加入枯草芽孢桿菌的辛硫磷濃度降至468 mg/kg、丙溴磷降至504 mg/kg，加入EM菌的辛硫磷濃度降至518mg/kg，丙溴磷降至625 mg/kg，均達到農藥原濃度的1/2。從表1中還可看出，加入枯草芽孢桿菌的處理降解要快于加入EM菌的處理。

2.2 枯草芽孢桿菌對甲基對硫磷的降解效果

2.2.1 降解茵性能試驗結果表明，枯草芽孢桿菌在水體中生長的最適pH值為7.5；在pH 5.0～9.0范圍內，枯草芽孢桿菌均表現出良好的降解性能，pH 7.0時其對農藥降解效果更好，故選擇pH 7.0～7.5為最佳酸度條件。

溫度對枯草芽孢桿菌生長影響的試驗結果表明，其適宜生長溫度為25～35℃。最適生長溫度為30℃。水解試驗結果表明，溫度在25℃時，枯草芽孢桿菌表現出高效的降解能力，故認為環境溫度選擇在25~35~C為宜。

在實驗室評價了枯草芽孢桿菌對目標農藥的降解性能，結果表明，枯草芽孢桿菌具有非常強的降解目標農藥(甲基對硫磷)的能力，是一株比較理想的降解菌。在水解試驗中，甲基對硫磷在水體中降解非常緩慢，21天后濃度變化很小，求出的t1/2為46.5天；加入枯草芽孢桿菌后，其濃度顯著降低，求出的t1/2為11天左右。在土壤降解試驗中，也表現出相當高效的降解能力。當土壤中甲基對硫磷濃度低于500 mg/kg，加入枯草芽孢桿菌后，24 h降解率達45.0％～49.2％，而相應未投加降解菌的對照土壤中僅為10％。

2.2.2 降解茵在不同土壤環境中對農藥的降解作用

(1)枯草芽孢桿菌在滅菌土壤中對農藥的降解效果

稱取過10目篩的土壤1 kg裝盆，用紗布包扎盆口，用Co-γ射線進行輻照滅菌。在超凈工作臺上加入農藥和菌懸液，同時設不接種為對照。置25℃條件下培養，定時取樣測定土壤中農藥的含量，結果顯示，在滅菌土壤中農藥的降解非常緩慢，在8天中農藥只降解了8.5％，而接種菌以后，土壤中農藥的降解非常迅速，在4天內農藥即降解到檢測限以下。這充分說明土壤中農藥的降解作用是由外加微生物引起的。

(2)枯草芽孢桿菌在非滅菌土壤中對農藥的降解效果

試驗結果顯示，在自然非滅菌土壤中農藥的降解要比滅菌土壤中快得多。這是因為農藥在自然土壤中，除了化學降解及物理降解外，還有土壤微生物的作用。而接種了枯草芽孢桿菌后，土壤中農藥的降解則更為迅速。在培養1.5天后，自然土壤中農藥只降解了24.4％，而在接菌的土壤中農藥已降解了62.1％。到第5天，接菌的土壤中已經檢測不到農藥，而在自然土壤中同樣的過程則需要12天。這表明在接菌土壤中，接種的微生物對土壤中農藥降解的作用是明顯的，接種降解菌可以大大加速農藥的降解。

2.2.3 茵劑不同用量對土壤中農藥的降解效果

先用一定量的水將土壤潤濕，然后稱重，將土壤置于燒杯中，每處理裝土100 g(5個處理)，然后從上面均勻地滴加農藥，使各處理土壤初始農藥濃度均為50 mg/kg(以干土計)。再均勻地滴加不同量的菌劑(5、1、0.5、0.1 m1，CK)，并使各處理土壤的水分保持一致，室溫放置3天，測定各處理土壤中農藥的含量，結果見表2。

由表2可知，加入降解菌可大幅度提高降解率。經過3天時間，未加菌的對照土壤中農藥降解率僅為31.0％，而4種不同菌劑量的處理，降解率均達到了82.3％以上，表明該菌對農藥降解率隨菌劑量的增加而提高。但是，當菌劑量達到一定程度后，降解率增加的趨勢變緩。當菌劑量從0.1 ml增加到0.5 ml時，降解率的增加值為5.6個百分點，而菌劑量從1 ml增加到5 ml時，降解率的增加值則僅為0.2個百分點。所以，在某一處理條件下，存在一個最佳菌劑用量。

2.2.4 菌劑加入方式對土壤中農藥的降解效果

微生物對農藥的降解效果因農藥及降解菌加入方式不同而有很大差異，這是因為農藥和降解菌在土壤中的移動性，加入方式直接影響到農藥與降解菌的有效接觸。為此探討了農藥與微生物的有效接觸問題。分別討論了兩種情況：

(1)農藥和菌劑同時都從土柱上部加入

先用一定量的水將土壤潤濕，然后稱重，用等量的土制成2個土柱，分別從上面加入等量的農藥，其中一個土柱從表層均勻滴加菌劑，另一土柱則均勻滴加等量的水。然后于室溫放置3天。3天后將2個土柱分成上、中、下3層分別取樣，每層3 cm，分別測定各層土壤中的農藥含量。

試驗結果顯示，在未加菌的土柱中，甲基對硫磷絕大部分集中分布在0～3 cm的上層，土壤中農藥含量為98.3 mg/kg，而中層和下層土壤中的農藥含量則很低，分別為0.994 mg/kg和0.172mg/kg。這表明該農藥的移動性較差，極易被上層土壤吸附。而在加菌土柱中，3層土壤中農藥的含量都很低，上層土壤中農藥含量為46.4 mg/kg，中層和下層土壤中的農藥含量分別為0.584 mg/kg和0.155 mg/kg。表明吸附在土壤上層中高濃度的農藥已被枯草芽孢桿菌降解。

(2)茵劑在土壤垂直方向的移動性

先將受試農藥與土壤充分拌勻，使土壤中農藥的初始濃度為50 mg/kg(以干土重計)，然后將土壤分成等量的2份制成2個土柱，其中一個土柱由土壤上部加入菌劑，另一個土柱不加菌，而加入等量的水。然后于室溫條件下放置3天。3天后將2個土柱分成上、中、下3層分別取樣，每層3 cm。

測定結果顯示，未加菌的各層土壤中農藥含量較為接近，但有微小差別，即上層<中層<下層，這是由于表層土壤的光照及通氣條件都優于下層土壤，農藥的自然降解作用相對較強之故。

加菌土柱各層中農藥含量與未加菌的土柱相比，其上層和中層土壤中農藥含量大幅度降低，降解率比未加菌的土柱分別高59％和38％，而下層土壤中農藥含量仍很高。由此可以推斷，當從土壤表層加入菌劑時，降解菌有一定的移動范圍，在本試驗條件下降解菌的活動范圍為上層和中層土壤，即降解菌可達6 cm的深度。

2.3 噴施菌劑對土壤中農藥的降解效果

試驗時間選在7月15日至8月2日，氣溫28～34℃。試驗地點為菏澤市牡丹區李丁樓村，土壤為壤質潮土。每處理的試驗小區面積為2 m²。土壤中農藥為人為施的甲基對硫磷，農藥濃度設計為22.5 kg/hm²。菌劑用量設計為5、10、15、30和40 kg/hm²。農藥和菌液分別用壓力噴霧器均勻噴施，噴施農藥1天后噴施菌液，定期采集土樣測定其農藥含量。48 h試驗測定顯示，降解菌對受試土壤中農藥具有很好的降解作用。隨著菌劑用量的增加，土壤中農藥降解效果越明顯。當菌劑用量為15 kg/hm²時，48 h后降解率已達45.9％；當菌劑用量為30 kg/hm²時，降解率達65.2％；隨后菌劑量的增加對土壤中農藥的降解率效果不大。所以在本試驗條件下，選擇菌劑用量30 kg/hm²為最佳用量。

在實際應用中，須根據土壤中農藥含量多少，適當選擇最佳菌劑用量，才能達到預期的降解去除效果。

3 結論

本試驗分別探討了EM菌和枯草芽孢桿菌對有機磷農藥的降解性能，研究結果表明，水解試驗中，EM菌和枯草芽孢桿菌對辛硫磷、丙溴磷降解比較明顯，枯草芽孢桿菌對土壤中受試農藥甲基對硫磷具有較強的降解能力，在本試驗條件下，最適菌劑用量約30 kg/hm²，對土壤中農藥降解去除率達80％以上。