應(yīng)用改進(jìn)的免疫熒光組織化學(xué)染色法對水稻根尖細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的觀察

摘要：植物細(xì)胞微管在細(xì)胞形態(tài)建成中具有重要作用。它體積小，且結(jié)構(gòu)始終處于動態(tài)變化之中，因此觀察到清晰的微管形態(tài)有一定的困難。本實(shí)驗(yàn)以水稻根尖為材料，介紹了一種改進(jìn)的植物細(xì)胞微管免疫熒光組織化學(xué)染色方法，用此方法可以觀察到清晰、完整的植物微管形態(tài)，此法對觀察其它植物細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)也具有指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞：植物細(xì)胞；微管；水稻根尖；免疫熒光組織化學(xué)染色

中圖分類號：S511；Q245 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001－4942(2010)04－0040－04

1963年，Ledbetter、Poter和slautterback幾乎同時分別在植物和動物細(xì)胞的超薄切片中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中存在一種超微結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)就是細(xì)胞骨架之一——微管。從微管被發(fā)現(xiàn)并被確認(rèn)后，它一直是細(xì)胞生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。然而，植物細(xì)胞微管體積較小，其外徑僅3～12 mm，且構(gòu)成微管的微管蛋白始終處于動態(tài)變化之中，因此觀察到清晰而又完整的微管形態(tài)成為這一研究領(lǐng)域的難題。本實(shí)驗(yàn)以水稻根尖為材料，通過免疫熒光的方法，應(yīng)用共聚焦顯微鏡對微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并在傳統(tǒng)的免疫熒光制片方法的基礎(chǔ)上對樣品酶解和壓片等步驟進(jìn)行了改進(jìn)，最終觀察到形態(tài)清晰、結(jié)構(gòu)比較完整的微管。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻“中花11”(Oryza sativa L cv.Zhonghua11)在人工氣候箱培養(yǎng)，采用水培方法，生長的光暗周期為16h(光照)/8h(黑暗)，生長溫度為(30±0.5)℃，相對濕度為70％。待水稻幼苗長出5d后，取初生根根尖部位進(jìn)行微管結(jié)構(gòu)觀察。

1.2 主要試劑

免疫熒光實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑為纖維素酶、果膠酶和β－微管蛋白一抗(馬抗小鼠，產(chǎn)品貨號：19026)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗(產(chǎn)品貨號：F0257)，均購自Sigma公司(Mis，souri，USA)。其它化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 材料處理及應(yīng)用共聚焦顯微鏡對微管結(jié)構(gòu)的觀察

1.3.1 取樣及固定用解剖刀切下水稻根尖約5 mm，將其放入含有1.5％多聚甲醛的PEMT緩沖液(50 mmol/L PIPES、5 mnM/L EGTA、5 mmol/LMgSO4、O.05％(V/V)Triton X-100，pH 7.2)中固定1 h，用PEMT緩沖液洗滌3次，每次10 min。

1.3.2 酶解傳統(tǒng)方法：用含有0.5％(W/V)果膠酶和lI 5％(W/V)纖維素酶的PEM緩沖液(50mmol/L PIPES、5 mmol/L EGTA、5 mmol/L MgSO4，pH 7.2)37℃條件下酶解70 min；改進(jìn)后：用含有0.5％(W/V)果膠酶和1％(W/V)纖維素酶的PEM緩沖液37℃條件下酶解1 h，用PEM緩沖液洗滌3次，每次10 min。

1.3.3 壓片傳統(tǒng)方法：把處理好的材料放到載玻片上，并用鑷子弄碎，蓋上蓋玻片。改進(jìn)后：將根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的蓋玻片上，將兩張蓋玻片交錯相疊，夾在濾紙中間，壓片，弄好后要室溫干燥5 min。

1.3.4 孵育以含有50 mmol/L GIy的PBS溶液(16 mmol/L Na2HPO4、4 mmol/L NaH2POd、150mmol/L NaCl，pH 7.2)處理材料30 min。

1.3.5 抗體標(biāo)記材料加入到一抗(a－tubulin抗體1：600)中，4℃反應(yīng)過夜，用PBS洗滌3次，每次10 min，之后加入二抗(1：200)，孵育3 h然后用PBS洗滌3次，每次10 min。

1.3.6 封片 將處理好的材料置于含有0.1％(W/V)間苯二胺的PBS一甘油(1：1，pH 9.0)的防熒光淬滅的載玻片上，以蓋玻片壓好封片。

1.3.7 觀察用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察、采集圖像。FITC所帶的綠色熒光激發(fā)波長為488nln，用Carl Zeiss LSM META 510激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，激發(fā)波長范圍為595～530 nm，以40倍油鏡(Plan－APOCHROMAT，NA1.3)采集數(shù)據(jù)。圖像存儲為1024×1024像素類型，ZOOM設(shè)為1.0，用26％的激發(fā)光強(qiáng)度掃描。采集到的微管圖像用Photoshop 6.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用傳統(tǒng)方法與改進(jìn)方法對水稻根尖細(xì)胞內(nèi)的微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖1。圖1－a顯示，在酶解70 min的情況下，用含1.5％纖維素酶的酶解液酶解，很容易破壞細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)而破壞微管完整性，導(dǎo)致觀察到錯誤結(jié)果。經(jīng)過反復(fù)地摸索和不斷嘗試，最終發(fā)現(xiàn)1.0％纖維素酶加0.5％果膠酶最適于水稻5～10 d的根尖細(xì)胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)的固定及觀察，并且酶解時間要根據(jù)水稻根的生長時間而定，萌發(fā)5 d幼苗所需最佳酶解時間為1 h。這個處理時間既能夠充分保證細(xì)胞壁的酶解，又不破壞細(xì)胞形態(tài)，如同時加入0.4 mol/L露醇，則酶解溶液的滲透勢與細(xì)胞內(nèi)的滲透勢相近，更有利于酶解后細(xì)胞形態(tài)完整性的保持(圖1－b)。

顯微觀察過程中，如果要在共聚焦激光顯微鏡下得到清楚的圖像，就必須盡可能地使所觀察物處于同一個聚焦平面上，即如果觀察細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，則用單細(xì)胞層觀察的效果比較好。所以應(yīng)用傳統(tǒng)的壓片方法時，不同細(xì)胞層之間的相互干擾比較嚴(yán)重，很難看到單細(xì)胞層及細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，且抗體反應(yīng)也不明顯，特異性不強(qiáng)，看不到清晰的微管結(jié)構(gòu)(圖1－c)。我們將壓片方法進(jìn)行了改進(jìn)，即將根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的蓋玻片上，將兩張蓋玻片交錯相疊，夾在濾紙中間進(jìn)行壓片，并將壓好后的片子于室溫下干燥5 min后再加入抗體進(jìn)行免疫。這樣做既保證了抗體與細(xì)胞間的充分接觸，對材料的機(jī)械傷害也較小，最終獲得了比較好的觀察效果(圖1－d)。

通過摸索和試驗(yàn)，我們最終總結(jié)出一套適合于觀察水稻根尖部細(xì)胞內(nèi)微管形態(tài)的免疫熒光組織染色方法，利用該方法制備的樣品，細(xì)胞內(nèi)微管形態(tài)完整，圖像清晰，觀察效果較好。可清晰地看到經(jīng)抗體免疫后呈垂直于細(xì)胞壁方向排列的微管結(jié)構(gòu)(圖2)。

3 討論與結(jié)論

水稻是廣泛應(yīng)用于植物生物學(xué)及相關(guān)研究領(lǐng)域的模式植物，對其根部細(xì)胞骨架動態(tài)變化的觀察及研究，不僅可闡明水稻根部發(fā)育的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，對研究其它植物根部發(fā)育也具有指導(dǎo)作用。同時，水稻根部的結(jié)構(gòu)較簡單，葉綠素含量少，因此可以作為觀察微管形態(tài)的理想材料。以往對水稻根部細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的觀察主要通過顯微觀察、電鏡切片及冰凍蝕刻等方法，但這些方法存在操作復(fù)雜、目的性差、圖片清晰度不高等不足，難以滿足試驗(yàn)的要求。隨研究手段的不斷提高，目前認(rèn)為，觀察微管形態(tài)的最好方法之一是免疫熒光組織化學(xué)染色法。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用傳統(tǒng)方法獲得的水稻根尖部細(xì)胞內(nèi)微管形態(tài)結(jié)構(gòu)的圖像整體比較模糊，結(jié)構(gòu)不清晰，不能用來說明問題。免疫熒光組織化學(xué)制片過程中，酶解是關(guān)鍵步驟之一，如果酶解時間不夠，則與微管相免疫的抗體就無法充分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，最終無法觀察到微管的形態(tài)；如果酶解時間過長或酶解程度過高，如應(yīng)用1.5％纖維素酶酶解，則會破壞細(xì)胞形態(tài)，從而破壞微管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。本實(shí)驗(yàn)將酶解方法進(jìn)行了改進(jìn)，取得了較好的效果。同時，我們還對壓片的方法進(jìn)行了改進(jìn)。傳統(tǒng)方法中，壓片不徹底，導(dǎo)致細(xì)胞層間相互干擾，抗體免疫專一性差。改進(jìn)后，我們將水稻根尖放在涂有1％多聚酪氨酸的蓋玻片上進(jìn)行壓片，之后再加入抗體，在保證抗體與細(xì)胞充分接觸的條件下保證了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，對微管的顯微觀察效果也比較好。

微管是細(xì)胞骨架的重要組成成分，在植物生長發(fā)育過程中具有重要的生理功能。隨著人們對其研究越來越深入，其在維持細(xì)胞形態(tài)、染色體遷移、細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞壁構(gòu)建和信號傳導(dǎo)等中的作用也越來越受到重視。目前，熒光免疫技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展使得進(jìn)一步從組織、細(xì)胞和分子水平上揭示它的結(jié)構(gòu)和功能成為了可能。而在顯微水平上對細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)的制樣及觀察可為該方面研究的深入提供技術(shù)保證。在顯微結(jié)構(gòu)的靜態(tài)觀察成為可能后，如何實(shí)現(xiàn)對微管解聚和聚合這一動態(tài)過程的活體觀察，了解與之相關(guān)的胞內(nèi)信息傳遞及所傳遞信號如何影響生物體的生長發(fā)育，將是進(jìn)一步工作中亟待解決并闡明的問題。