甘薯莖尖超低溫保存技術研究

摘 要:本試驗采用包埋玻璃化法超低溫冷凍技術保存徐薯18號的莖尖，結果表明，當剝取莖尖大小為1.0～1.5 mm，玻璃化處理時間為90 min時，莖尖存活率達85%以上。

關鍵詞:徐薯18號;莖尖;包埋玻璃化法

中圖分類號:S531.024 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)05-0055-02

長期以來，甘薯的很多品種在推向生產后迅速退化，喪失新品種的優良種性，對甘薯的產量與品質造成極大影響[1]，因而如何較好地收集和保存甘薯種質資源逐漸受到重視。目前常用的保護植物種質資源的方法都有著各自的局限性。眾多的試驗表明，超低溫冷凍保存植物種質技術是較為理想的一種方法[2]。在超低溫(一般指液氮低溫，-196℃)條件下，幾乎所有的細胞生長代謝活動都停止進行，而細胞發育成完整植株的潛能和遺傳信息得以保存，更有利于保持遺傳穩定性[3]，且超低溫條件能夠將種質所感染的真菌和細菌病原物一并脫除，脫毒種質的再生苗在一定時期內沒有病毒、細菌和真菌病害，其生活力特別旺盛[4]。包埋玻璃化法結合了玻璃化法與包埋脫水法兩個超低溫技術的優點，能在同一時間內處理大量材料且植物恢復生長較快，凍存植物莖尖不經愈傷組織而直接成芽，其發育成的植株無形態變異且有更高的成芽率，目前已成功應用于馬鈴薯和蘋果[5，6]等多種植物。由于莖尖分生組織細胞分化程度小，比其它組織細胞培養物的遺傳性穩定[7]，是較為理想的超低溫保存材料，因而本試驗采用甘薯莖尖分生組織作為試驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料

徐薯18號，由山東省農業科學院作物研究所甘薯室提供。

1.2 方法

1.2.1 包埋及預培養 在6-BA添加濃度為0.5 mg/L的MS培養基上培養帶芽莖段10～12 d，分別剝取大小為0.5、1.0～1.5、2.0～3.0 mm的莖尖。將莖尖移入2.5% Na-alginate溶液中，隨后將莖尖連同Na-alginate溶液放入預冷的0.1 mol/L CaCl2溶液中，約20 min后形成小球(直徑約4 mm)。包埋后25℃、90 r/min預培養。

1.2.3 玻璃化溶液脫水 將小球移入玻璃化溶液PVS中進行玻璃化處理，設計處理時間對比，分別為0、30、60、90、120、150 min。

1.2.4 冷凍保存 將小球快速置入液氮中，處理1 h。設置一組不經液氮處理的對照。

1.2.5 解凍及恢復培養 將盛有小球的超低溫管快速轉移到38℃的水浴鍋中解凍3 min。將小球轉移到1.2 mol/L蔗糖卸載溶液中，處理20 min。將小球移入成活培養基中，黑暗培養3 d，然后轉到正常光周期培養7 d，置于電子顯微鏡下觀察成活狀況。

2 結果與分析

2.1 莖尖大小對存活率的影響

試驗表明，1.0～1.5 mm大小的莖尖成活率可達到80%以上， 而0.5 mm和2.0～3.0 mm莖尖成活率則低于50%(表1)。1.0～1.5 mm大小的莖尖再生能力較高[8]，且機械剝離操作較為方便簡單。

2.2 玻璃化溶液處理時間對存活率的影響

玻璃化溶液即冰凍保護劑PVS，可以有效降低冰點，從而阻止植物體內冰晶的形成，減少細胞的失水，降低對植物組織的傷害。處理時間過短，則不能有效地降低冰點，易產生冰晶;而由于PVS本身具有較強的毒性，若處理時間過長，植物組織受毒害而死亡。試驗結果(表2)表明，徐薯18號的最適宜處理時間為90 min，成活率達85%以上。

3 討論

徐薯18號作為淀粉型甘薯品種在全國大面積應用，具有產量高、品質好、抗病性強、適應性廣、增產潛力大等特點，既可用作鮮食品種，又可用作淀粉加工及燃料乙醇生產專用品種。作為北方主栽品種，無論是在生產力還是品質方面都有突出優勢，有著較高的保存和研究價值，因而為本試驗所采用。

超低溫冷凍保存種質在多種植物中都早有研究，但在甘薯中的應用卻鮮有報道。本試驗針對不同品種，在操作過程中對其冰凍前的馴化、冷凍處理時間及其再生條件進行了優化組合配置，獲得了較為適宜的配置條件。且本試驗選用莖尖的分生組織為材料，細胞分化程度小，在再生過程中比其它組織細胞培養物的遺傳性穩定，并有著更高的再生效率，更有利于種質的優良品質保存。

參 考 文 獻:

[1] 李洪民，邢繼英，馬代夫，等.甘薯抗病毒種質資源的鑒定與篩選[A]. 中國甘薯育種與產業化學術研討會論文集[C].成都，2005，17-21.

[2] 吳雪梅，湯浩茹.包埋玻璃化法超低溫保存植物種質的研究進展[J].植物學通報，2005，22 (2): 238-245.

[3] Kartha K K. Plant cell and tissue culture[M]. Dordrecht:Kluwer Acadecmic Publishers，1994，195-230.

[4] 安穎蔚，孟令文，張 輝.馬鈴薯脫毒及微型薯繁育技術體系的研究與應用[J].雜糧作物，2006，26(3):197-199.

[5] Hirai D， Sakai A. Cryopreservation of in vitro grown meristems of potato (Solanum tuberosum L.) by encapsulation-vitrification[J]. Potato Research，1999，42:153-160.

[6] Paul H，Daigny G，Sangwan-Norreel B S.Cryopreservation of apple (Malus×domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulation-vitrification[J]. Plant Cell Reports，2000，19:768-774.

[7] Kartha K K. Cryopreservation of plant cells and organs[M]. Boca Katon， Florida:CRC Press，1985，276.

[8] Wang Q C， Jari P T，Valkonen.Cryotherapy of shoot tips:novel pathogen eradication method[J].Trends in Plant Science，2008，14(3):119-122.