梨自交親和性研究進展

摘 要:本文簡要介紹了梨自交不親和性的表現及其調控機制，著重對梨自交親和性突變的類型、分子機制、研究進展和研究方法進行了概括，并對梨花粉授粉識別研究中尚待解決的問題進行了展望。

關鍵詞:梨;自交親和性突變;分子機理

中圖分類號:S436.421.1+9 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)05-0026-04

植物的自交不親和性(Self-Incompatibility，簡稱SI)是指能產生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同株植物，在自花授粉或相同基因型異花授粉時不能受精的現象[1]。根據花粉自交不親和性的遺傳控制機制，通常把自交不親和性分為配子體自交不親和(Gametophytic Self-Incompatibility， GSI)和孢子體自交不親和(Sporophytic Self-Incompatibility， SSI)[2]。梨(Pyrus L.)的自交不親和屬于配子體自交不親和，生產中必須配置授粉樹或人工輔助授粉，才能獲得產量。這不僅加大了果園生產投入、費時費力，而且當授粉樹配置不當、人工授粉不及時或花期遭遇不良氣候而影響昆蟲傳粉時都會造成減產。因此，加深對梨自交不親和性機制的認識、研究其自交親和的機理并選育自交親和品種，顯得尤為重要。

1 梨自交不親和性的表現及機制

梨的自交不親和多是由單一的S位點控制的，這個位點至少包括編碼1個花柱組分和1個花藥組分的基因，也就是所謂的S基因。S基因的產物決定了花粉在柱頭萌發和花粉管在花柱組織中生長的命運[3]。梨屬植物自花授粉時，花粉能夠在柱頭上萌發并穿過柱頭，但花粉管在沿花柱向子房生長過程中受到抑制不能到達胚珠，也就不能受精結實[5]，這屬于配子體自交不親和。

在配子體自交不親和的植物中，花粉萌發后花粉管都能夠沿花柱的引導組織向子房方向生長，但是不親和性花粉的花粉管長到一定的長度后會停止生長，因此S基因如何區分自花和異花花粉是配子體自交不親和研究的核心問題。由于花粉的S基因型尚未鑒定出來，嘗試去發現與S等位基因共分離的花粉蛋白也未成功，故無法確定控制花柱自交不親和行為的S基因是否也參與控制花粉的行為。根據相關實驗結果，人們提出了花柱S-RNase抑制自花花粉管生長的模型，但具體區分的分子機理尚不太清楚，目前“膜受體學說”(Receptor Model)和“胞內抑制劑說”(Inhibitor Model)[6]這兩種假說的支持者較多。

1.1 膜受體學說

S-RNase被花粉S基因產生的膜受體特異性地攝入，只有不親和的RNase(與花粉S基因型相同的S糖蛋白)能通過橫跨膜受體進入花粉管并降解花粉管中的RNA。花柱內花粉管周圍的S糖蛋白與花粉的等位基因的專一受體發生特異性反應，選擇性地進入自花花粉管，降解花粉管的mRNA和rRNA，從而抑制其生長。但這種模型很難解釋二倍體加倍和S位點基因片段重復的花粉自交親和現象。

1.2 胞內抑制劑說

不親和的S-RNase和親和的S-RNase都能進入花粉管，親和的S-RNase(與花粉S基因型不相同的S糖蛋白)可以被花粉S基因編碼的一種特異的胞內RNase抑制劑抑制而失去活力。花粉管周圍的S糖蛋白均能進入花粉管，S糖蛋白進入帶有不同S等位基因的花粉管時，遇到高度專一性抑制物質的抑制，但花粉管內沒有與該花粉管相同S基因型的抑制物質存在，從而選擇性地降解相同S基因花粉管的RNA，最終抑制花粉管伸長。這種假說可以成功地解釋二倍體花粉是自交親和的原因。Luu等(2000)[7]運用花粉管的免疫組織化學標記方法，證明了親和的和不親和的花粉管的細胞質中都有S-RNase的積累，這為抑制劑假說提供了佐證，但至今尚未搞清這種抑制劑為何不對自體核酸酶發生抑制。

2 梨自交親和突變的機理

梨屬于典型配子體自交不親和植物，但自然界中存在自交親和突變的品種，因此梨的自交親和性機理的研究是在對自交不親和性深入理解的基礎之上建立起來的。在自交不親和反應花柱和花粉相互識別復雜過程的本質問題中，科學家們提出了種種假說，也挖掘到了許多自然存在或人工誘變產生的自交親和變異品種，這無疑為自交親和性機理研究提供了寶貴的遺傳材料。

自交親和變異的途徑有自然突變和人工誘導突變，現已發現的配子體型自交親和變異包括花柱變異和花粉變異，進一步研究發現花柱或花粉變異導致的自交親和性多數是由于花柱S-RNase基因或花粉F-box基因的突變、插入、缺失引起的。

2.1 花柱變異

中國梨(Pyrus bretschneideri Rehd)‘鴨梨’(S21S34)的芽變自交親和品種‘閆莊梨’，初步推斷它的自交親和性可能是由于花柱突變所致[8]，即其花柱失去識別自己花粉的功能，而花粉行為和其原始品種相同。利用S21和S34等位基因特異性引物對‘閆莊梨’自交后代S-RNase基因型進行鑒定，結果發現S21在所有后代中均有擴增條帶，進一步證明可能是‘閆莊梨’花柱S21等位基因及其編碼產物發生了突變;蛋白質印跡雜交分析結果表明，其花柱S-RNase缺失了一條帶，而沒有缺失的條帶蛋白含量也比鴨梨低。由此證明‘閆莊梨’的自交親和性可能由于花柱S-RNase的突變和表達量低所致。但尚未見報道確認花柱S-RNase之一缺失是造成‘閆莊梨’自交親和性突變的唯一原因，或是也與另一花柱S-RNase表達量少有關。另外，在蛋白水平上是不是S21-RNase缺失和表達量降低的原因還有待基因組水平和基因轉錄水平的研究[8]。與此類似的還有日本梨品種(P.serotina)‘二十世紀’(S2S4)的無性芽變自交親和品種‘奧嗄二十世紀’。Sassa等(1997)[9]推測‘奧嗄二十世紀’自交親和的原因是花柱表現為S4-RNase突變的嵌合體，但不能遺傳給后代，S4-RNase基因在頂端分生組織L1、L2層缺失。吳華清等(2008)[10]通過對‘二十世紀’(S2 S4)、‘奧嗄二十世紀’(S2 S4SM)、自交后代54S -135 (S4SMS4SM)、雜交后代‘秋榮’(S4SMS5)的進一步研究，提出了S4-RNase基因只在頂端分生組織L1層缺失的觀點。還有結果指出花柱S4-RNase基因缺失了236 kb序列，使得花柱S-RNase喪失了識別自己花粉的功能，其花粉S基因功能仍保持正常。

2.2 花粉突變

中國名牌梨‘鴨梨’的自然芽變品種‘金墜梨’[11]、‘黃花梨’的芽變品種‘大果黃花’[12]等就是很好的例子。吳華清等鑒定了‘鴨梨’和‘金墜梨’基于S-RNase基因的S基因型，發現兩者S基因型相同，均為S21S34;克隆了兩品種S-RNase基因cDNA全長序列并進行比較分析，發現兩品種的1對雌蕊S -RNase基因在核苷酸序列上完全相同，且S-RNase基因均正常表達，表達量沒有明顯差異，從分子水平上證實了金墜梨在花柱方面和鴨梨并無差異，推測出可能是花粉S基因發生突變導致其自交不親和性功能的喪失[11]。但是由于目前花粉的S基因尚未鑒定出來，花粉S基因的表達產物未知，所以花粉究竟是如何突變，到底是哪個等位基因還是兩個都發生變異，有待于進一步研究。‘黃花梨’的芽變品種‘大果黃花’與‘金墜梨’的研究結果相近。

3 梨的自交親和突變機理的研究方法

3.1 田間授粉試驗

以突變品種和原始品種為試材，進行自交、正反交和回交試驗，調查花序和花朵的坐果率，推斷出自交親和的原因是源于花粉突變還是花柱突變[8～12]。具體方法是，開花前1天或當天采集花蕾，取出花藥，室內25℃條件下待其自然開裂，花粉散出后，收集花粉作授粉用。自花授粉時，于花朵開放前選留2～3朵邊花，其余摘除，然后套袋，待花藥散粉后，輕輕搖動，以確保授粉和授粉量;正反交試驗于開花前分別去雄后授粉，再套袋。自授粉當天算起15天后調查花序和花朵坐果率。

3.2 花粉管原位萌發熒光檢測技術

授粉后96 h切取部分花朵的花柱[13]，在FAA固定液(95%酒精15 ml，冰醋酸 5 ml，福爾馬林5 ml)中固定24 h轉移到100%酒精中。固定液中取出柱頭及花柱，用清水沖洗干凈后，用NaOH溶液軟化處理，然后用苯胺藍染色液染色。經染色處理后的花柱做成壓片，用熒光顯微鏡，觀察花粉管在柱頭上萌發和在花柱中的生長情況，并進行顯微拍照和測數，判斷兩品種的親和性。

3.3 S -RNase基因鑒定

采用改良的CTAB法提取葉片的DNA，根據梨S1～S7-RNase 保守序列FTQQYQ 和anti-IIWPNV設計通用引物PF(5′-TTTACGCAG2CAATATCAG-3′) 和PR (5′-ACA /GTTCGGCCAAATAATT-3′)[14]。利用DNAMAN、BioEdit分析軟件對比研究自交親和變異品種與原始品種S基因序列及結構特點，以期找到兩者之間的差異，并解析序列結構差異與自交不親和反應差異的關系。

3.4 S -RNase基因的RT-PCR檢測及全長cDNA克隆

參照徐義流等(2004)[15]的方法提取花柱、花粉、子房、花瓣、萼片、幼葉等組織總RNA，參照張小燕克隆櫻桃S基因的方法[16]，設計花柱及花粉S基因的特異性引物，轉錄成cDNA模板，PCR檢測花柱S-RNase與花粉F-box基因的組織特異性表達情況，并分析不同發育階段的表達差異。

3.5 花柱可溶性蛋白IEF-PAGE分析

屬于配子體自交不親和性的梨，研究其自交不親和性基因(S基因)在雌蕊花柱中的表達發現，其產物是具有核糖核酸酶活性的糖蛋白(通常稱為S糖蛋白)，因此，通過鑒定品種的花柱S基因產物—S糖蛋白的種類和相對含量，就可以知道S基因在花柱中的表達情況，進而推測自交親和性變異的原因。提取大蕾期花柱中的可溶性蛋白質，進行等電聚焦電泳(IEF-PAGE )分離[17]后，用銀染色譜圖中各蛋白質的顯色帶來觀察。

4 展望

對梨的自交親和性的研究是當前國際梨分子生物學研究的熱點之一，梨自交不親和性機理的研究已頗為深入，特別是在雌蕊內控制自交不親和性的基因分離及鑒定方法已日臻完善。但在梨樹育種工作中充分利用自交親和性突變，還有賴于自交不親和性調控機理的進一步研究。目前亟需解決的問題有:①花粉中S基因的分離與鑒定;②確定花粉S基因的表達產物的定性和定量方法;③花粉的S基因產物和花柱S糖蛋白在花粉與雌蕊互作中的作用。掌握了梨的自交親和性分子機理，對培育自交親和的梨新品種具有重要理論指導意義，使得一個果園栽培一個品種成為可能，簡化了生產程序，降低了果園成本。

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