Q型煙粉虱種群微衛星位點BEM06的變異檢測

摘 要:煙粉虱B型和Q型是兩種入侵性較強的生物型，在山東省農區混合分布。B型與Q型入侵種群的快速鑒別對于進一步解析煙粉虱群體遺傳結構及其防控有重要意義。在前期研究的基礎上，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術檢測了國內外27個Q型種群和1個B型種群微衛星BEM06位點。結果表明:微衛星BEM06位點不能有效鑒別山東省B型與Q型煙粉虱。山東省的Q型煙粉虱入侵來源與西班牙有密切關系。

關鍵詞:煙粉虱;微衛星位點;生物型;生物入侵

中圖分類號:Q503 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)05-0005-04

煙粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)又名棉粉虱、甘薯粉虱，是一種嚴重危害農業生產的害蟲。煙粉虱的幼蟲和成蟲通過攝取植物汁液直接危害寄主植物，還可以傳播110多種植物病毒[1]，分泌蜜露誘發霉污病影響光合作用，導致農作物減產[2，3]。煙粉虱通常被視為包括許多生物型的復合種，迄今為止有30多個生物型被命名，其中B型和Q型煙粉虱是兩種入侵性較強的生物型。近期研究發現，在我國許多地區Q型與B型混合發生并成為了煙粉虱的優勢生物型[4]。迄今為止，國內發現的Q型煙粉虱均為Q1型煙粉虱[5]。

微衛星(microsatellite)又稱為簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)，廣泛分布于真核生物基因組中，呈孟德爾式遺傳，可鑒別出雜合子和純合子，更能有效地揭示遺傳多樣性。微衛星分子標記已經基本取代了其它標記在生態和進化研究中的地位，廣泛應用于入侵生物種群來源鑒定、瓶頸效應、雜交和基因滲透、入侵因素等許多方面的研究[6]。McKenzie等[7]研究發現B型煙粉虱BEM06等位基因與Q型煙粉虱(即煙粉虱Q1型[5]，包括Q2與Q3線粒體型)不同。我們前期研究[8]表明:B型煙粉虱BEM06位點有a、b兩種等位基因，以等位基因b為主(98.8%);而所試驗的4個Q型種群中個體有5.6%的等位基因與B型等位基因(b)相同，且該等位基因僅存在于原產地西班牙1個種群，并不存在于我國云南省的Q型煙粉虱入侵種群中。因此，利用該微衛星位點可以鑒別B型與我國云南省Q型煙粉虱入侵個體。

煙粉虱(B型與Q型)在山東省農區廣泛分布[9，10]，近年來Q型煙粉虱(即Q1型)種群不斷擴散蔓延[4，11]。B型與Q型煙粉虱的快速分子鑒定體系的建立，對于進一步解析煙粉虱群體遺傳結構及其防控有重要意義。微衛星分析通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測，該方法具有分辨率高的特點，可以很好地將相差幾個堿基的片段區分開。本試驗利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對B型、Q型煙粉虱微衛星位點BEM06進行分析，旨在探索利用該微衛星位點鑒別山東省B型與Q型煙粉虱入侵個體的可能性，同時基于研究結果探討山東省Q型煙粉虱的入侵來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

地中海地區及我國臺灣、美國煙粉虱樣品由澳大利亞CSIRO昆蟲所De Barro博士提供，所有種群生物型的鑒定利用mtCOⅠ引物C1-J-2195和2819-R[12]擴增測序確定。山東各地采集的煙粉虱樣品，個體生物型的鑒定參考Khasdan等[13]和Ueda[14]的方法，利用內切酶VspⅠ與StuⅠ為基礎的mtCOⅠ-CAPS。所有個體浸泡在95%酒精中，于-20℃保存備用，試驗共使用煙粉虱樣品387頭，其中，377個Q型個體和10個B型個體(見表1)。

1.2 微衛星BEM06位點擴增與檢測

單頭煙粉虱DNA的提取參照De Barro和Driver[3]的方法，PCR反應體系包括:2 μl反應緩沖液，1 U Taq酶，0.2 mmol/L dNTPs，BEM06上下游引物各0.2 μmol/L，模板DNA為2 μl。在Eppendorf PCR儀上進行反應，條件參照De Barro等[15]的方法稍有修改，為94℃預變性5 min;94℃1 min，50℃ 1 min，72℃1 min，共35個循環;最后72℃延伸10 min。將PCR產物用6×的變性緩沖液于96℃變性5 min。將PCR產物上樣于7.0%的變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳。在1倍TBE緩沖液、恒功率70 W條件下進行電泳后，銀染。根據等位基因的片段大小，判斷等位基因。

1.3 數據統計

統計了等位基因b在B型與Q型煙粉虱中的整體含量(百分比)。統計了等位基因b在Q型煙粉虱土著地區地中海種群中的含量及其在山東省Q型煙粉虱入侵種群中的含量。

2 結果與分析

2.1 B型和Q型煙粉虱的BEM06位點分析

本試驗結果表明，在BEM06位點，所選B型煙粉虱的等位基因只有b，為100.00%;而在Q型煙粉虱中，等位基因b占所有等位基因的4.56%(見圖1)。

2.2 Q型煙粉虱的BEM06位點分析

在地中海種群中，僅西班牙ES12種群檢測到20.00%等位基因b。而在山東省Q型種群中，除濟南種群(CNjn2)與德州種群(CNdz1)沒有發現該等位基因外，該等位基因在其它Q型煙粉虱種群中以6.67%～20.00%的含量存在(見表1)。其中，棗莊種群(CNzz1)的比例最高。

可見，BEM06位點等位基因b是西班牙Q型煙粉虱1個私有等位基因(private alleles)，在地中海其它Q型種群中并不存在。但在山東省7個地區的Q型煙粉虱中發現了該等位基因，這表明山東省Q型煙粉虱的入侵與西班牙Q型煙飛虱有密切關系。

3 結論

與討論鑒于煙粉虱Q型與B型的較強入侵性及其危害性，尋找一個簡便的適用于大量煙粉虱樣品生物型鑒定的方法具有重要意義。本試驗結果表明，在所選用的B型煙粉虱種群中僅有一個等位基因b。在西班牙種群ES12和山東省7個地區的Q型煙粉虱種群中，也均有等位基因b的發現，且在一些種群中，等位基因b的比例高達20.00%。因此，單獨使用BEM06位點無法有效鑒別山東省Q型與B型煙粉虱入侵種群。

利用分子遺傳學的方法，通過比較入侵物種在起源地和入侵地的遺傳相似性和私有等位基因的分布，可以確定入侵物種的來源地區[16]。Q型煙粉虱被認為起源于地中海地區[17～19]，隨著花卉的運輸傳入我國[20]。在本研究中，微衛星BEM06位點等位基因的分布情況表明，入侵山東省的Q型煙粉虱與西班牙土著種群有密切關系。這與我們進一步利用線粒體與微衛星分子標記研究的結論，即山東省Q型煙粉虱可能源于地中海西部國家如西班牙、摩洛哥等地區(另文發表)是一致的。

致謝:澳大利亞CSIRO昆蟲所De Barro P.J.博士為本研究提供相關材料，在此表示感謝!

參 考 文 獻:

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