楊樹葉片離體再生系統的構建

摘 要:以楊樹葉片為外植體，MS為基本培養基，使用不同激素不同濃度配比，建立了楊樹葉片離體培養植株再生體系。結果表明:葉片的最佳誘導培養基為:MS+2，4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;不定芽培養基為:MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。NAA與BA對愈傷組織誘導有調控作用，NAA/BA比值增大有利于不定芽的誘導，但不能超過4∶1;BA與2，4-D關系比較復雜，當2，4-D和6-BA的濃度均為1.0 mg/L時，愈傷組織誘導效果最好。

關鍵詞:歐美108楊葉片;組織培養;植物生長調節劑

中圖分類號:S792.110.5 文獻標識號:A 文章編號:1001-4942(2010)05-0008-03

楊樹是世界上廣泛栽培的重要造林樹種，因其速生豐產、無性繁殖能力強、基因組較少而成為林木遺傳改良的理想模式植物[1]。自1964 年Mathes獲得楊樹試管苗以來，國內外許多學者采用楊樹莖尖、葉片、莖段和腋芽做外植體，均獲得成功，但以葉片培養增殖倍率高[2]。筆者采用歐美108楊的嫩葉為外植體，MS為基本培養基，使用不同激素不同濃度配比，建立了楊樹葉片離體培養植株再生體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以歐美108楊一年生枝條為材料，扦插土培一個月后，取剛剛生長出的幼嫩葉片作為外植體。

1.2 外植體的滅菌、接種、培養

以葉片為外植體，自來水沖洗30 min，10%酒精消毒10 s，無菌水沖洗2次，每次1 min，0.1% HgCl2浸泡4 min，無菌水漂洗4遍，每次2 min。葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小方塊，葉背向下平放于培養基中。培養溫度25℃，光照14 h/d，光照強度2 000 lx。

1.3 培養基基本培養基為MS培養基，添加不同激素組合、30 g/L蔗糖、6.5 g/L瓊脂，配制成M1～M6共6種培養基(表1)。在滅菌前調節培養基pH值到5.8 ，并且在0.1 MPa (121℃) 的條件下保持20 min ，以達到滅菌的效果。

2 結果與分析

2.1 楊樹葉片愈傷組織的誘導將經處理的外植體均勻接種于M1、M2、M3、M4、M5、M6 培養基上誘導愈傷組織。表2 表明，在M1、M2、M3、M4、M5 培養基上幾天后大部分外植體開始膨大，2～3 周后長出綠色或紅色的愈傷組織。其中，M2、M3培養基上出現大量愈傷組織，基本為綠色，少量為紅色，致密，數量明顯多于M1 培養基;M4、M5 培養基上出現較多的不定芽，愈傷組織很少，且M4 誘導產生的不定芽明顯多于M5;但M6 培養基上的外植體只表現為輕微膨大，兩周后褐化死亡。

NAA與BA對愈傷組織的誘導有調控作用，NAA/BA比值增大有利于不定芽的誘導，但當NAA與BA比值為4∶1時，無愈傷組織出現，也不誘導不定芽，這表明生長素含量過高的培養基不適合誘導愈傷組織。BA與2，4-D關系比較復雜，當2，4-D和6-BA的濃度均為1.0 mg/L時，愈傷組織誘導效果最好。另外，帶葉柄的葉片出現愈傷組織所需的時間短，并且通常在葉柄處先出現白色膨大，逐漸長出綠色的愈傷組織

2.2 楊樹葉片不定芽的誘導將在M3培養基上誘導得到的愈傷組織接種于M4培養基上進行不定芽的誘導培養，4周后，愈傷組織誘導出大量不定芽。

2.3 楊樹不定芽的繼代和生根培養將在不定芽誘導培養基上獲得的叢生芽單個接種在繼代培養基(MS+6-BA 0.1 mg/L+ NAA 0.02 mg/L+GA3 0.2 mg/L)上繼代增殖培養，3～4周后選長勢良好的不定芽接種于生根培養基(MS+IBA 0.5 mg/L)，4周后得到生根的完整小植株。

3 討論

歐美108 楊扦插繁殖簡便易行，但受制于季節因素，利用組織快繁能打破這種限制。其它楊樹品種的組培快繁已有一些研究報道[3，4]，孫宇飛等(2004)[5]成功建立了歐美107 楊組織培養再生系統，但歐美108 楊組織培養再生系統研究未見報道。較其它品種楊樹而言，該品種具有顯著的速生性能和優良的品質，進行耐鹽轉基因研究有廣泛的應用開發前景。因此，該系統的建立具有重要的理論和實踐意義。

試驗中，幼嫩葉片和葉柄切口處雖然有少量褐色物質滲出，但幼嫩外植體的細胞分裂能力很強，在切口處依然有愈傷組織形成，基本上不會影響愈傷組織的誘導率。若以較老的葉片、葉柄做外植體，則切口處褐變現象嚴重，隨著培養時間的延長，褐變面積會從切口處擴展到整個外植體，進而影響愈傷組織的誘導率。造成這種后果的原因可能有:①外植體的成熟程度影響誘導率。通常情況下，褐變隨材料的年齡和組織木質化程度的增加而增加。②取材時期不合適。很多關于組織培養的報道都提出取材時期會影響外植體的褐變[6～9]。李昆(2007)[6]研究發現，在3～4月間取剛萌發的葉片、葉柄甚至莖段作外植體，消毒工作很容易進行，所用消毒時間較短，向外滲出的褐色物質很少，而且外植體分化能力很強，基本上在外植體邊緣發生的小部分褐變不會影響到誘導率。另外，在超凈工作臺上切割外植體時，手術刀要鋒利，切割要迅速準確，切口保持平整，避免傷害過大。同時，外植體切下后，要迅速接入培養基，避免其切口與空氣長時間的接觸。

參 考 文 獻:

[1] 林善枝，肖基滸，張志毅.楊樹分子標記研究進展[J].北京林業大學學報， 2000，22(6):79-83.

[2] 馬同富，馬宗新.楊樹葉片高效離體再生系統的構建[J].中國農學通報，2007，23(12):88-92.

[3] 王學聘，韓一凡，戴蓮韻，等.抗蟲轉基因歐美楊的培育[J].林業科學，1997，33(1):69-74.

[4] 杜寧霞，李 云，于海武，等.毛白楊葉片再生系統的建立(英文)[J].中國林學(英文版)，2002，2(4):48-51.

[5] 孫宇飛，高秀華，趙彥修，等.歐美107楊組織培養再生系統的建立[J].山東師范大學學報，2004，19(2):85-87.

[6] 李 昆.I-63楊和I-69楊組織培養研究[D].武漢:華中農業大學碩士論文，2007.

[7] 王玉珍，劉香玲，羅景蘭.大葉飼料型刺槐組培技術體系的研究[J].山東農業科學，2005，4:9-11.

[8] 蔡小寧，楊 陽，楊 平，等.鹽芥葉片組織培養再生植株的研究[J].安徽農業科學，2008，36(1):42-43.

[9] 于志水，金 紅，王麗鈞，等.黑楊派楊樹組培再生系統的研究[J].遼寧林業科學，2002，6:11-13.