辣椒單倍體培養研究進展

摘要:對影響辣椒單倍體培養的幾個主要因素:材料基因型、發育時期、預處理培養基等進行了綜述。不同的材料甚至采用相同培養條件，胚狀體的誘導頻率差異也不同。當花瓣與花萼等長或花瓣稍長于花萼，花藥為綠色或花藥末端略帶淡紫色時，是最適合單倍體培養的時期。NHT培養基是比較適合的培養基。經過適當的預處理(低溫、高溫、無碳源、甘露醇、秋水仙素等)，并加入0.01～0.5 mg/L的激素(BA、KT、NAA、2，4-D)和防止褐化(3 mg/L硝酸銀)會大大提高胚狀體發生。但總體來講辣椒單倍體培養發展較慢，還有許多方面需要改進。通過近一步深入系統研究，辣椒單倍體培養技術會有突破性進展。

關鍵詞:辣椒;單倍體;培養;花藥;小孢子

中圖分類號:S641.3 文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.04.004

Perspectives of Pepper Haploid Culture

SU Wei1， CHANG Cai-tao2

(1.Gansu zhangye Academy of Agricultural Sciences， Zhangye， Gansu 734000， China;2.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute ，Tianjin 300384， China)

Abstract:The critical factors involving in haploid culture were summarized in this paper including geno-types， the stage of pollen development， pretreatment， medium. The inducing frequencies of embryo greatly fluctuated on different materials even in same culture conditions. When the length of petals were same as that of calyx orslightly longer than that and the anthers were green or light purple， it was the best time to collect explants of haploid culture. NHT medium was more suitable medium than others. The appropriate pre-processing ， such as low temperature， high temperature， non-carbon sources， mannitol， colchicine， and reasonable hormones addition 0.01～0.5 mg/L (BA， KT， NAA， 2，4-D)， as well as the chemicals preventing browning (3 mg /L AgNO3)had greatly enhanced somatic embryogenesis. In general， the advancement on the research of pepper haploid cultivation was sluggish and there were multiple aspects need to be improved. It was expected pepper haploid culture technology would get a breakthrough based on the further systematic research.

Key words: pepper;haploid;culture;anther;microspore

辣椒(Capsicum annuum L. ) 原產于中美洲和南美洲， 因其營養豐富、味道鮮美而在世界各地廣泛種植， 其產量在茄科蔬菜中僅次于番茄。辣椒在我國各地均有栽培， 年播種面積超過66.7 萬hm2，已成為農民致富的重要經濟作物之一。

辣椒的遺傳改良對生產起著重要的作用。在辣椒育種過程中，自交系的選育是非常關鍵的工作，但傳統的育種方式往往存在周期長、育種群體規模大、育種選擇效率低等問題。單倍體育種是解決這些問題的重要育種方法之一。花藥和小孢子培養是獲得單倍體的主要方法，能夠在較短時間獲得遺傳純合的材料，可大大縮小育種群體規模，縮短育種年限，提高育種效率。但目前在實際工作中還存在許多問題，如花藥培養由于受花藥各部分組織的干擾，培養產物可能不是由花粉而來的，致使產生不同倍性的體細胞混雜體;小孢子培養可以有效避免花藥培養中因母體組織帶來的雜合體，但技術要求和難度比花藥培養苛刻，同時小孢子會在游離后迅速大量死亡。為此，筆者就可能影響單倍體培養的主要因素逐一論述。

1培養材料

1.1基因型

研究表明，不同基因型辣椒之間誘導率的差異是極顯著的，李春玲[1]、Kristiansen等[2]對不同基因型材料采用相同的培養條件，胚狀體的誘導頻率變化差異很大。陳曉等[3]發現，在43個辣椒供體基因型中，胚狀體誘導頻率從18%降至0。在利用雜交種作接種材料時，雙親中有較高誘導頻率的，其雜交種的誘導頻率也較高。研究中大部分結果顯示，大果基因型材料比小果的誘導頻率高，二者雜交后代誘導頻率介于雙親之間。對一些基因型特別是辣椒種間雜交種，目前仍無獲得花培單倍體苗的報道，關于控制胚狀體誘導頻率的基因及遺傳規律尚在研究。不同的基因型致使花藥誘導率不同。即使在同一種內，不同的基因型仍有很大的差別。一般認為茄科植物對游離小孢子培養比較敏感，但不同植物反差也很大，基因型對小孢子胚胎發生能力的決定作用主要體現在2個方面:一是基因型的反應范圍，另一個是胚胎發生頻率的差異。

1.2發育時期

李春玲等[1]指出小孢子的發育與花蕾的外部形態有一定的相關性。在正常季節，單核靠邊期的花蕾長度一般為0.4～0.45 cm，花瓣與花萼等長，剝掉花瓣所見花藥顏色為黃綠色或略帶紫色。Qin[4]的研究也發現，花藥的顏色和長度及花瓣和花萼的長度都與小孢子的發育階段有著密切的聯系，當花瓣與花萼等長度或花瓣稍長于花萼，花藥為綠色，花藥末端略帶淡紫色時，小孢子處于單核至雙核早期，最適于誘導小孢子胚發育。目前辣椒花藥培養工作大多以此為標準。王燁等[5]認為，進行辣椒小孢子培養時花蕾的標準是:花瓣花萼等長或瓣稍長于萼，并且內部花藥尖端微紫，各個品種的花蕾在這個階段小孢子大部分處于單核期。

2培養條件

2.1預處理

預處理包括低溫、高溫、無碳源、甘露醇、秋水仙素等預處理。把待分離的花蕾放在較低的溫度下(4～10 ℃)處理一段時間，可提高小孢子胚的誘導率。劉凡等[6]在7，32，35 ℃ 8 d處理均能誘導小孢子胚狀體發生，但花藥培養中7，35 ℃處理下的出胚率較32 ℃下高。 Duncan[7]認為，低溫可以延緩花粉退化，使更多花粉有可能開始新的細胞周期。高溫預處理是指在正常溫度下培養之前，先在高于培養溫度下培養一段時間，也叫熱激。Touraev等[8]認為，熱激及其他一些物理、化學方面的脅迫處理可能在小孢子內部產生了同樣的效果，如產生一些特異蛋白(HSPs)。王燁等[5]研究發現，辣椒品種Milord在36 ℃下進行2 d的高溫預處理效果最好，小孢子存活率最高。

無碳源也叫饑餓處理，即在培養基中不加碳源。王燁等[5]研究發現，77013、83-58和Milord 3個辣椒品種經在饑餓處理后小孢子的存活率均高于對照。Miyoshi研究結果表明，熱激處理與蔗糖饑餓處理對于雄核發育的啟動有較好的效果。另外，秋水仙素影響紡錘體的形成，甘露醇主要對小孢子內源激素水平產生影響，這可能影響到胚或愈傷的形成。王燁等[5]研究發現，秋水仙素和甘露醇預處理對5個辣椒品種的影響因材料不同有不同反應。低濃度短時間秋水仙素處理存活率相對較高。秋水仙素在1 mg/L時存活率高，甘露醇10 mg/L的處理效果最好。

2.2培養基

在辣椒花藥培養中，基本培養基對誘導愈傷組織、胚狀體的發生起十分重要的作用。科研工作者對基本培養基進行了大量的嘗試和創新。王玉英等[9]在培養甜椒品種旅大時，試用了NTH(NT的大量元素加上NH的活性物質)、MS和N6培養基，N6培養基上只形成了愈傷組織，沒有胚狀體形成，發現NTH培養基上胚狀體發生頻率最高。Ramon[10]也認為改良的NH培養基提高了單倍體胚的發生頻率。陳肖師[11]比較了MS、H、B5、Nitsch和 NTH 5種培養基，以MS和NTH培養基效果最好。在一些成功的試驗中，往往是利用兩種或兩種以上培養基聯用方式，即先在一種培養基中培養一段時間后，再轉入另一種培養基中繼續培養。如張子君等[12]人先將花藥在一種培養基培養一段時間后轉入另一種培養基中繼續培養，獲得了很好的誘導效果 。激素的種類、配比及濃度直接決定了花粉發育的類型(形成胚狀體或愈傷組織)、二倍體細胞(如藥壁、藥隔等)等的增殖和單倍體花藥的生長。目前廣泛應用于花藥培養中的激素有BA、KT、NAA、2，4-D等生長素，對細胞分化形成愈傷組織及其生長有決定作用，但如果濃度過高會抑制花粉發育，促進二倍體細胞的生長，而低濃度生長素則更適于誘導花粉產生愈傷組織或直接產生胚狀體。李春玲等[1]采用0.25～0.5 mg/L NAA+1 mg/L KT，附加50 mg/L的單核苷酸，胚狀體的誘導和分化達到了較好的效果，王玉英等[9]研究表明，高濃度的2，4-D、NAA促進了愈傷組織的形成而降低了胚狀體的形成，低濃度的2，4-D效果不佳，而低濃度的NAA、IAA有利于胚狀體的形成。國外辣椒花藥培養中，卻較多采用2，4-D和KT配比。匈牙利學者采用Dumas的方法，得出不同材料有不同的培養基激素要求，在誘導培養基中加入0.01～0.05 mg/L 2，4-D，0.01～0.05 mg/L KT，在繼代培養基中加入0.1～0.3 mg/L KT效果較好，誘導培養基中加入0.08 mg/L 2，4-D，0.08 mg/L KT，繼代培養基中加入0.3 mg/L KT是出胚的上限。Matsubara等[13]發現在MS培養基上附加KT 0.02 mg/L 或2，4-D 0.004 mg/L+KT 0.02 mg/L可誘導胚狀體高頻率發生，當附加2，4-D 0.03 mg/L+KT 0.1 mg/L或2，4-D 0.1 mg/L+KT 0.1 mg/L時，則誘導愈傷組織高頻率發生。總的來說，在辣椒花藥培養中加入適當濃度的激素有利于胚狀體和愈傷組織的形成，而加入激素的濃度及組合應根據接種材料的基因型進行具體分析，通過多次試驗來確定適宜的配方。盡管采用的激素種類及配比不同，但激素濃度應控制在0.01～0.5 mg/L之間。

硝酸銀和核酸類物質可以減輕組織培養中材料的褐化程度，促進胚狀體的產生。S.Mastubara等[13]的研究表明，硝酸銀是影響胚狀體誘導率的最主要因素，在不加硝酸銀的對照培養基中，甜椒花藥培養10 d后開始褐化，20 d后全部褐化死亡;三磷酸腺苷鈉鹽是影響胚狀體發生的次要因素，沒有添加核酸類物質的對照培養基中沒有誘導出胚狀體，所以核酸類物質在彩色甜椒花藥培養中非常重要。王立浩等[14]研究發現，硝酸銀、抗壞血酸均可以通過降低組織褐化提高胚狀體的發生率。王燁等[5]研究發現，用3 mg/L AgNO3能夠在很大程度上提高愈傷率。

糖類物質(蔗糖、麥芽糖、果糖)作為花藥培養的碳源，其中辣椒花藥培養主要采用蔗糖碳源。王玉英[9]對不同蔗糖濃度進行了對比，發現培養10 d后，12%蔗糖濃度中活花粉和已分裂花粉數量較多，20 d后，較高濃度的培養基中(9%，12%)花粉大量死亡，而低濃度(3%，6%)中，已分裂的花粉能繼續發育成胚。張子君[12]先在3%蔗糖濃度MS培養基上培養8 d后，移至2.5%蔗糖濃度的MS培養基上，誘導率明顯提高，蔗糖濃度降至2%時誘導率則降低。王立浩等[14]在培養中比較了蔗糖、果糖、麥芽糖的培養結果，認為麥芽糖作為碳源的胚狀體誘導頻率高。活性炭的添加進一步完善了花藥培養，一般認為它可以吸附培養基、空氣及試材所釋放的抑制物質，但同時也會吸附有益物質，如 NAA、BA、Fe-EDTA等。王玉英[9]認為添加0.5%的活性炭是有益的。活性炭的用量一般為0.5%～3%。也有研究表明，在高壓滅菌之前加入活性炭會降低培養基的pH。陳曉等[3]認為，0.25%的活性炭濃度已經足夠，0.25%～0.5%活性炭的效果差異不明顯。Ramon 發現活性炭提高胚發生率的同時也增加了不正常胚的發生率。目前活性炭的作用機理尚不清楚。

2.3溫度和光照

溫度和光照對辣椒花藥培養的效果起重要作用。早期的研究工作多在24～30 ℃恒溫條件下進行培養，而現在多采用變溫處理。Ramon 采用4 ℃低溫誘導后，28 ℃持續培養。光照強度和光照時間的研究無系統報告，一般在進行35℃高溫培養的8 d中采用暗培養，再轉入1 500～2 000 lx，25～28℃下培養，光照時間10～12 h。光質對植株再生有不同的影響，往往光合作用的光譜對再生作用最有效，在實驗室培養過程中最常用的是白色熒光。

另外接種密度對胚狀體的影響報道較少，但李春玲[1]在花培工作中發現，接種密度直接影響辣椒胚狀體誘導頻率，其研究結果表明，在50 mL三角瓶中接種10個花蕾，其胚狀體的誘導頻率最高，提高接種密度可以節省許多材料，但同時也須加快接種的操作速度，否則污染率升高。

自20世紀70年代辣椒花藥培養首次獲得單倍體植株以來，進而又發展了辣椒小孢子培養技術，并被應用于辣椒育種中，但總體來講發展較慢，還有許多方面需要改進。通過進一步深入系統研究，辣椒單倍體培養技術會有突破性進展，把單倍體培養技術和傳統育種技術有機結合起來，必將給辣椒育種帶來更大收益。

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