分子標記在木本油料植物種質資源和育種研究中的應用

摘要:簡述了分子標記在木本油料植物品種鑒定、遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析、親緣關系分析、分子輔助育種等方面的應用和取得的進展，并探討了分子標記技術在木本油料植物研究上存在的問題和應用前景。

關鍵詞:分子標記;木本油料;種質資源;遺傳育種

中圖分類號:S565 文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.04.007

Application of Molecular Marker in Germplasm Resources and Breeding of Woody Oil Plants

LI Feng-ming1， BAI Yu-e1， ZHANG Hua-xin2， FENG Yong-wei3

(1. Forestry College，Inner Mongolia Agriculture University， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China; 2.Institute of Forestry，China Academy ofForestry，Beijing 100091， China; 3. Hangzhou Seedlings Nursery， Hangzhou，Zhejiang 310007， China)

Abstract:The application and progress of molecular markers in such fields as cultivar identification， genetic linkage map construction， genetic diversity analysis， genetic relationship analysis， molecular assisted breeding， and so on for woody oil plants was presented， and the exiting problems and application prospects about these was also discussed in this paper.

Key words: molecular markers; woody oil plants; germplasm resources; genetic breeding

油料植物是指植物體內(果實、種子或莖葉) 含油脂8%(或現有條件下出油效率達80%以上)的植物。據報道，世界植物油脂產量占世界油脂總產量的70%左右，其中食用油占80%左右，非食用油約占20%[1]，且大部分來源于草本油料植物。隨著人口的增加，可供農耕的土地面積的減少，耕地資源和糧食安全生產制約了草本油料植物的發展。然而，木本油料植物的種植不占用農耕土地，可在山地、丘陵、灘地、干旱瘠薄乃至沙地發展，可為農民增收的同時產生一定的社會效益和生態效益。《中國油脂植物》中記載，全國有108科、397屬、814種油脂植物[2]。其中，木本油料就有400多種，含油量在l5%～60%的有200多種，含油量為50%～60%的有50多種。至今，尚有大量野生資源待開發利用。

隨著經濟社會的發展，人們保健意識的增強，市場經濟的繁榮，綠色食品的興起，木本糧油食品倍受青睞。人類對木本油料方面的科學研究由來已久，主要集中在資源調查、引種栽培、生態生物學特性、繁殖技術、遺傳育種、造林栽培技術、油脂營養成分和化學成分分析、油脂開發利用等方面。近年來，生物技術開始滲透并帶動木本油料研究的深層發展，為高產抗逆油料植物品種培育開辟了新道路。分子標記(Molecular marker)是以生物大分子的多態性為基礎的一種遺傳標記，是繼形態標記、細胞標記、生化標記之后發展起來的一種更為理想的遺傳標記形式[3]。其概念有廣義和狹義之分，廣義的分子標記是指可遺傳的且可檢測的DNA序列或蛋白質。狹義的分子標記是指能反映生物個體或群體間基因組中某種差異的特異性DNA片段[4]。相對而言分子標記有以下優點:(1)直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否的問題;(2)數量極多，遍布整個基因組，可檢測的基因座位幾乎是無限的;(3)多態性高，自然界存在許多等位變異，無需人為創造;(4)不影響目標性狀的表達，與目標性狀無必然的連鎖遺傳現象，表現為“中性”;(5)許多標記表現為共顯性的特點，能區別純合體和雜合體[5]。

DNA分子標記的這些特點，奠定了它具有廣泛應用性的基礎，此技術已經應用于木本油料植物分子遺傳圖譜的構建、遺傳多樣性分析與種質鑒定和輔助選擇育種等方面，并取得了一定的成績，具有廣泛的應用前景。

1品種鑒定

品種鑒定需要具備高效、準確、不受環境等因素影響的鑒定技術。傳統田間性狀鑒定和籽粒形態鑒定雖簡單易行，但受栽培措施及環境因子影響較大，影響檢測準確性。利用同功酶和蛋白質電泳圖譜的鑒定技術雖具有靈敏度高、準確、易操作等優點，但同功酶位點及蛋白質種類有限，不能完全顯示品種間的多態性，也很難滿足種子純度和種質資源及育種工作發展的需要[6]。而分子標記技術提供了更為有效的品種鑒定方法，利用分子標記繪制品種(系)的指紋圖譜，作為品種(系) 的特征性狀建立種質資源檔案庫，可用于鑒別品種(系)。目前，分子標記主要用于油橄欖、核桃、油茶等重要木本油料植物的研究。

Hagidimitriou等[7]對8個和34個希臘主栽油橄欖品種進行了RAPD和AFLP分析，并進行了聚類分析。研究表明，由于不同地域間交換品種頻繁，導致劃分的類群與其地理分布沒有明顯關系，而與果實大小明顯相關。

Raul等[8]對23個油橄欖品種進行了SSR分析，用來檢測其l1個后代的父本或潛在父本，結果表明其中4個為自交子代表現為純合，這說明在油橄欖育種中SSR是一種有效評價雜種和自交不親合的技術。Angiolillo等[9]利用AFLP技術對43個油橄欖品種和野生種進行了遺傳相似程度的計算，并建立了遺傳進化樹圖。

吳樹敬等[10]從100個隨機引物中篩選得到18個引物，對參試杏品種進行擴增，均具有多態性，多態性達48.6%，找到了重現性好的品種特異譜帶。建立了20個品種的指紋圖譜，每個引物的鑒別率在10%～70%之間，用不同的引物組合結合特異譜帶可以鑒別所有的參試杏品種，證明RAPD技術是果樹品種鑒定的有效方法。

Nicese等[11]用RAPD標記分析了19個核桃品種的遺傳關系，聚類分析結果顯示與經典的分類結果一致，表明RAPD標記能準確反映彼此的系譜關系，首次為核桃的育種及種質資源分析奠定了基礎。

楊兆順等[12]用100個隨機引物對36個糯玉米資源作RAPD比較分析，結果顯示:所分類群并不能和任何一個已知表型性狀分類完全吻合，所以認為用單純幾個引物進行聚類分析并不能精確地劃分類群，如果要精確劃分，還需要進行大量多引物重復試驗和田間試驗。

吳燕民等[45]用RAPD技術對核桃屬內9個種及近緣屬的2個種進行基因組DNA多態性分析，結果表明，鐵核桃為核桃屬中一個獨立種;核桃屬內組間和種間親緣關系與經典分類學的結果完全一致。

溫強等[46]采用ISSR分子標記技術，僅用9條引物就建立了25個無性系的鑒別體系，其中受檢測的108個位點中，特征位點就達95個，引物UBC895貢獻20個位點，可一次性鑒別25個無性系，無論從擴增多態性還是鑒定效率上都具有顯著效果，各無性系具有各自不同的指紋，也同時論證了各無性系遺傳背景相對獨立，這為優良無性系進一步向良種推廣應用以及在無性系基礎上進行種質雜交創新奠定了一定的分子基礎。

Fabbri[47]對分布于地中海地區的17個油橄欖品種，用40個隨機引物進行擴增，結果發現，這些油橄欖的種質資源中存在大量多態性。經過聚類分析，這17個品種可分為小果群和大果群二大類型，與形態學分類一致。

2遺傳圖譜構建

遺傳連鎖圖譜(Genetic linkage map)又稱為遺傳圖譜，是指以染色體重組交換率為相對長度單位，以遺傳標記為主體的染色體線狀連鎖圖譜[13-15]。遺傳圖譜是基因組研究的重要內容，也是種質資源、育種及分子克隆等研究的理論依據和基礎。構建遺傳圖譜，一要有合適的分離群體，二要有能揭示親本多態性的遺傳標記。20世紀80年代以來，隨著分子標記的迅速發展，為在較短時間內構建相對高密度的連鎖圖譜提供了強有力的工具。應用分子標記構建遺傳連鎖圖譜比基于性狀分離的傳統作圖方式速度快、效率高、圖譜位點多。

譚曉風等[16]在山茶屬植物RAPD分子鑒別的基礎上開展油茶cDNA文庫和 EST文庫的構建，獲得106庫容量的油茶種子油脂轉化高峰期cDNA文庫;在所構建的cDNA文庫中挑選2 000多個克隆進行測序分析，從中分離出油茶種子中與脂肪酸、蠟合成和代謝有關的主要基因。

Wu等[17]用RAPD，SSR，SCAR等多種分子標記技術，以Frantoio和Kalamata的雜交Fl 為供試材料，構建了油橄欖的連鎖遺傳圖譜，品種Frantoio的圖譜的長度為759 cm，由92個標記組成，平均標記間隔為11.5 cm，分屬27個連鎖群;Kalamata的圖譜長度為798 cm，由89個標記組成， 平均標記間隔為12.3 cm，分屬23個連鎖群;兩者的聯合圖譜長度為879 cm，由101個標記組成，平均標記間隔為10.2 cm，分屬l5個連鎖群。并估計整個油橄欖基因組的長度為3 000 cm。總的來說，這些遺傳圖譜存在標記數目偏少，聯合圖譜只覆蓋了整個基因組的30%，而且平均標記間隔都在10 cm以上，飽和程度偏低，不利于這些連鎖圖的應用。但這些研究為后續研究和進一步進行圖譜整合打下了良好基礎。

劉威生等[18]對5個種的12份杏材料進行了ISSR擴增。用42個UBC引物對 12份材料進行了ISSR擴增。選擇多態性高的2個引物UBC825和UBC868就能把12份材料完全區分開，從建立了12份杏材料的ISSR指紋圖譜，說明用ISSR技術進行杏不同種、不同品種的鑒別或指紋圖譜分析是可行和有效的。

陳靜[19]在建立適合核桃的AFLP銀染技術體系的基礎上，構建了58份核桃供試樣品的指紋圖譜，并對其遺傳多樣性進行了分析，揭示了供試材料間遺傳背景的相似性及復雜性，為核桃的品種鑒定和產權保護提供了理論依據。

王紅霞等[48]利用AFLP分子標記技術對普通核桃131份材料的遺傳多樣性進行分析，構建了核桃的核心種質，并對核桃種間的親緣關系進行研究，將核桃屬8個種分為4個組:黑核桃組，野核桃、吉寶核桃和心形核桃組，鐵核桃、核桃楸和河北核桃組，普通核桃組。

陳碧云等[49]用4對AFLP引物在89份油茶區域品種中產生的67條多態性DNA譜帶構成了這些品種的特定DNA指紋圖譜數據。比對結果顯示，89份品種中沒有DNA譜帶完全相同的兩個品種，即利用這些特定的AFLP指紋數據能夠準確的鑒定這些品種。

3遺傳多樣性

遺傳多樣性是生命系統的基本特性，是物種適應自然和發生進化的遺傳基礎。樹木群體遺傳結構的變異和因此帶來的群體遺傳多樣性是遺傳學研究的重要領域。天然群體的遺傳多樣性程度和分布受遺傳褪變、遷移、突變和選擇等因素的綜合影響，其基因頻率會在一定的水平上波動，即遺傳多樣性會反映在DNA水平上，從而實現了對多態性的檢測，也從表型差異、同工酶分析發展到現在的分子標記法。同一基因型在不同的環境條件下可發育出不同的形態或生理特征，而相同的形態又可能涉及不同的基因型。表型變異如果沒有經過遺傳分析確證，嚴格地講不能稱為遺傳多樣性。同工酶所表現的蛋白質多態性由于受環境影響大，分析位點有限而受到限制。分子標記是對物種的基因組多態性分析，從而避免了環境和分析位點限制。

柳曉磊等[20]用SSR分子標記23對引物對11份椰子材料共擴增出142條帶，其中136條具有多態性，平均多態性百分率為95.77%，每個SSR位點的多態信息量(PIC)在0.173～0.896之間，平均為0.561，11份供試材料表現出豐富的多態性，部分供試材料間存在較大遺傳差異。

雷治國[21]通過18條引物對90個油茶優良無性系進行RAPD標記，得到569條多態性譜帶，其多態比率達94.7%，此外還獲得32條特異性譜帶。

王保明等[22]利用ISSR分子標記技術用10個引物對23個油茶無性系進行擴增，所得到的多態性比率為68.6%，Shannon遺傳信息指數為0.479 3。這表明，油茶無性系之間存在著一定的遺傳變異。

何承忠等[23]研究結果顯示，所檢測的腰果群體的多態位點百分率為38.33%， 等位基因數為1.383 3，有效等位基因數為1.150 4，基因多樣性指數為0.094 6，Shannon信息指數為0.149 2，從遺傳多樣性各項指標來看，該腰果群體具有較低的遺傳變異水平。

苑兆和等[24]采用熒光AFLP技術對來自4個生態群的普通杏進行遺傳多樣性分析，結果表明，普通杏種級水平Nei's 基因多樣度為0.143，Shannon信息指數I為0.226，多態性帶數A為130.86，多態帶百分比為60.58%，G為0.147。說明普通杏遺傳多樣性較為豐富，遺傳變異大部分存在于其生態群內。

阮曉賽等[25]通過AFLP和ISSR分子標記對17個毛竹種源進行分析，發現毛竹種源間的平均遺傳距離為0.067，同時筆者也利用AFLP和ISSR分子標記對毛竹及其9個變種的遺傳變異做了分析，發現它們間的平均遺傳距離為0.078 (未發表的數據)，這說明變種間的變異大于種源間的變異。根據形態學上的分析，毛竹的變種在竿的顏色、節間的形狀等方面存在諸多明顯差異。

洑香香等[26]用RAPD分子標記的方法檢測美國梧桐的種源，結果表明，其多態位點百分率比較高(66%)，但有效等位基因數和基因多樣性屬于中等，可以認為美國梧桐的遺傳變異水平為中等。對基因多樣性的分量分析表明，美國梧桐的遺傳變異主要來自于種源間的變異，占77%，而種源內的變異較小，占23%。

鄧洪平等[27]研究結果表明，九葉青花椒是花椒和竹葉花椒長期滲入雜交所產生的雜交復合體，且具有較高的遺傳多樣性，遺傳分化還在進一步加大。該結果對于實踐生產中九葉青花椒的選育及推廣具有一定的理論指導意義 。

李同和[28]利用AFLP銀染技術，對四川省3個核桃居群和1個鐵核桃居群的共46個樣品進行遺傳多樣性分析、居群遺傳結構分析及種屬關系探討，指出鐵核桃居群遺傳多樣性水平略高于核桃居群，各種多態性指數表明居群內的遺傳多樣性大于居群間，這為核桃種質資源的保護和育種提供一定的理論依據。

周飛梅等[29]采用RAPD分子標記、遺傳多樣性分析和聚類分析方法對100株油松材料的遺傳多樣性和遺傳基礎進行分析，共擴增出73條帶，其中具有多態性的條帶為64條，占總擴增條帶數的87.67%，顯示了油松群體內豐富的遺傳多樣性;從分子水平進一步證實這一觀點，并認為陜西省內的油松資源具有較豐富的多態性。

王傳堂等[30]用NTsys-pc軟件計算10個花生品種基于AFLP、SRAP、SSR/STS帶型兩兩之間簡單匹配系數值分別為0.793～0.989，0.670～0.917，0.647～0.806不等。條帶多態性率從高到低依次為SSR/STS(68.1%)>SRAP(57.12%)>AFLP(43.8%)。SSR/STS和SRAP分析采用的引物對數量在60條以上，其結果應有足夠說服力。

4親緣關系

樹木遺傳改良中，人工雜交是最基本的方法并取得了顯著成效。但無論是自然雜種或人工雜種都不同程度地存在著遺傳家譜的鑒定問題。樹木中存在許多天然雜種，有些品種是經實生選種或采用混合花粉雜交選育而成的，遺傳背景較為復雜，傳統的依靠形態標記、細胞標記及生化標記的分類方法存在許多爭議，對一些品種或類型無法判斷其親本，分子標記可以解決這方面的問題。

譚曉風等[31]從DNA水平對山茶屬油茶組及金花茶組植物進行分析，RAPD分析結果表明，油茶組植物分布范圍較廣，使得相容關系系數較小。油茶組的油茶、狹葉油茶(C.1anceoleosa)和越南油茶(C. vietnamensis) 親緣關系最近，與高州油茶(C. gauchowensis)也相對較近，而與茶梅(C. sasanqua) 的親緣關系較遠，這與形態上的差異完全一致。

何承忠等[32]研究結果顯示，所檢測的腰果54個樣株可以劃分為4個復合和 2 個獨立組。其中，39個樣株的遺傳親緣關系較近，4個樣株具有獨特的遺傳特性和育種利用價值。

吳樹敬等[33]根據RAPD分析結果對參試的20個杏品種進行了聚類分析， 結果表明，紅豐、新世紀、優系1、株系A、株系B、株系C與雙親紅荷包和二花槽聚為一類，說明它們之間的親緣關系很近。由此證明RAPD技術同樣是研究品種間的系譜關系與進化關系的有效方法。

劉曉麗[34]利用SSR分子標記技術對新疆伊犁野核桃、喀什實生核桃及部分栽培品種的遺傳結構進行分析，初步提出伊犁野核桃、喀什實生核桃和栽培品種的親緣演化關系圖，為栽培核桃品種的進一步選育提供分子依據。

周飛梅等[35]試驗結果表明，5個不同種群100株油松單株間的遺傳相似系數最低值為0.08，最高為0.66，說明陜西地區油松屬于同屬植物，且不同油松種群的親緣關系較遠。

王玉柱等[36]應用RAPD標記技術對包括“大扁杏”、西伯利亞杏和普通杏在內的杏品種間進行親緣關系分析，從聚類分析結果可以看出，3個“大扁杏” 品種( “一窩蜂”、“龍王帽”和“柏峪扁” )與普通杏品種有較近的親緣關系，同時與西伯利亞杏有更近的親緣關系。

另外，許多作者利用ISSR標記對桑種進行了親緣關系鑒定[37-39]。

5分子標記輔助育種

植物育種中分子標記輔助選擇(MAS)就是用DNA水平上的選種來代替以表型為基礎的選種，即通過分析與目的基因緊密連鎖的分子標記來判斷目的基因是否存在。通過分子標記分析可篩選出與目的基因(性狀)緊密連鎖的DNA片段或 QTL，作為輔助育種的分子標記。由于它不受環境、生長發育的限制可進行早期選種，從而縮短了世代間隔，提高了選種強度、選種效率和準確度。另外，對某些不期望的性狀也能夠及時發現和淘汰，因此，應用這些分子標記進行間接選種將會得到事半功倍的效果，特別是抗性育種。

Rosa等[40] 應用RAPD、AFLP、RFLP和SSR技術，在Leccino的基因組中標記了決定油橄欖果實中飽和與不飽和脂肪酸比率的硬脂酰-酰基載體蛋白去飽和酶基因(SAD)，此基因標記在Leccino的第4連鎖群中。

Mekuria[41]油橄欖抗葉斑病材料上獲得了與抗病基因連鎖的RAPD標記，并成功地將其轉化為STS標記，在12個油橄欖栽培品種中得到了驗證。

黃永芳等[42]用RAPD標記技術分析90份油茶種質，獲得與油茶抗病性、果油率和產油量3個數量性狀顯著相關的譜帶分別為13.1%、25.2%和34.5%，為選育高產、抗病的優質油茶品種，縮短育種進程，提高育種效率提供了參考。

史學群等[43]試驗結果表明，盡管在不同生境下所觀察到的楓香樹種外部差異明顯，但在遺傳物質上卻沒有大的差異，因此認為光照對楓香的生長密切相關， 其種群不適合生長在林下。

王金彥等[44]對花生EST-SSR分子標記結果表明，在NCBI數據庫中，共獲得437個SSR，占非冗余序列的6.0%。在Unigene基因文庫中，共獲得641個SSR，占非冗余序列的16.1%。盡管我們從NCBI中獲得的無冗余序列要比Unigene文庫中要多，但所獲得的含有SSR位點的序列卻不及Unigene文庫。這可能是由于在NCBI 數據庫中，大多數序列都是由較短的并且重復性較大的序列組成，而在Unigene文庫中，由于重復性較少，而且序列也較長，因此含有SSR位點的數目也較多。

楊克強等[50]用BSA法獲得了與核桃早實性狀相關的RAPD標記OPB—08，并對早實和晚實核桃品種進行了DNA擴增，只在早實品種的擴增產物中出現此條帶，并測出該標記序列為核桃基因組所獨有。

Nadia Goue等[51]用RACE技術(cDAN末端快速擴增技術)來隔離核桃CDKA基因的完整序列，并對該基因的結構與功能進行了首次描述，據其報道該基因與核桃木徑向生長和出材量有關。

分子標記在木本油料植物種質資源和育種研究中得到了廣泛的應用，無論是在品種鑒定、親緣關系、分子連鎖圖譜構建、輔助育種等方面都有著十分重要的理論與實踐意義。木本油料植物為多年生植物，性周期長，自交結實率低，個體雜合度高，植株高大，給普通遺傳學的研究帶來困難，由于對親本復雜的遺傳背景缺乏了解，育種中的盲目性很大。分子標記是輔助木本油料植物遺傳育種研究的有力手段，將大大加快木本油料植物育種的進程，縮短育種年限，提高育種效率;但目前DNA分子標記在木本油料植物中的應用存在不平衡，以RAPD為多，RAPD技術本身不穩定，給結果分析帶來了一定困難。此外，在構建遺傳圖譜、基因定位和分子標記輔助育種等方面的研究較少，且僅停留在質量性狀有關的研究，對數量性狀研究較少。總的來說，由分子標記提供的DNA水平上的信息本身不能滿足對資源研究的所有要求。隨著NDA分子標記的廣泛應用、分子生物學及相關邊緣學科理論與技術的迅速發展，必然不斷開發出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標記。隨著NDA提取、純化的程序化，電泳分析的自動化，數據處理計算機化及信息網絡化的進一步發展，DNA分子標記技術將在木本油料植物種質資源和育種研究中發揮越來越大的作用。

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