不同劑量雌激素對裸鼠血管瘤模型的影響

[摘要]目的:建立人毛細血管瘤裸鼠移植模型，探討血管瘤裸鼠模型建立的最佳條件。方法:將手術切除的1例雌激素受體陽性的兒童增生期血管瘤組織制成組織塊，植入20只裸鼠(BALB/ c nude mice) 皮下，每只4 處，將20只裸鼠分為4個實驗組。實驗1組在移植后給予普通鼠食喂養;實驗2 組在1組基礎上每周肌注雌二醇0.01 mg;實驗3組在1組基礎上每周肌注雌二醇0.1mg;實驗4組在1組基礎上每周肌注雌二醇1mg，于移植后第30、60、90天切取移植瘤。移植瘤標本進行病理學光鏡檢查，用血管內皮細胞單克隆抗體CD31、CD34進行免疫組化染色。 結果:移植后早期各組標本內皮細胞大量變性、壞死，30天后，單純喂養的實驗1組及實驗2組部分移植瘤開始吸收或形成膿腫及纖維化。實驗3、4組移植瘤開始緩慢生長。90天后實驗1組、實驗2組移植瘤均未成活，實驗4組移植瘤部分成活，而實驗3組移植瘤全部成活。光鏡下成活的移植瘤與原血管瘤組織生物學特點相似。 結論:不同劑量的雌激素對血管瘤裸鼠移植模型的建立有一定影響，適量的應用雌激素可建立穩定的人血管瘤裸鼠移植動物模型。該模型可以應用到基礎和臨床的血管瘤研究。

[關鍵詞]血管瘤;動物模型;裸鼠;雌激素

[中圖分類號]R732.2 [文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455(2010)02-0200-04

The effects of different estradiol dose on hemangioma model in nude mouse

MA Ge-jia1，YI Cheng-gang1， SUN Zhi-yong2，PEI Jiao-miao1，WANG Shi-ping1，XIA Wei1，GUO Shu-zhong1，YANG Li1

(1.Institute of Plastic Surgery， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， Shaanxi， China; 2. Department of Plastic Surgery， First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning， 530021， Guangxi， China)

Abstract:ObjectiveThe aim of this study was to establish the human hemangioma model in nude mice and investigate the best conditions for it. Methods Our specimen of the grafted strawberry hemangioma in proliferative phase was taken from a child patient by surgery， and made it into small pieces， then inoculated subcutaneously into 20 BALB/ c nude mice that were randomly divided into 4 groups， namely， group I (n=5) with normal diet， groupⅡ(n=5) with normal diet and 0.01mg estradiol administered intramuscularly every week additionally， groupⅢ(n=5) with normal diet and 0.1mg estradiol administered intramuscularly every week additionally， groupⅣ(n=5) with normal diet and 1mg estradiol administered intramuscularly every week additionally. The hemangioma tissues were harvested on the 30th， 60th and 90th days after graft and then subjected to histopathological examination and immunohistochemistry staining for CD31， CD34. Results In the early periods after graft， the endothelial cells of the specimens were degenerated and there were necrosis in all groups. The hemangioma tissues in groupⅠ andⅡ became absorbed or abscessed or fibrosis， however， the tissues in group Ⅲ and Ⅳ grew slowly in the first 30 days. The samples of hemangioma in groupⅠ and Ⅱwere disappeared completely， and survived partially in groupⅣ with a completely survival in groupⅢ after 90 days. The section of survived grafted hemangioma had similar biological characteristics with the original tissue under the light microscope.Conclusion The effects of different estradiol dose on hemangioma model in nude mouse were represent as quantum libet estradiol application could establish a stationary animal model of human hemangioma which have the potential to be used in foundation and clinical study on hemangioma.

Key words:hemangioma;animal model;nude mouse;estradiol

血管瘤(hemangioma) 是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，通常發病率約為0.3%～ 1%，好發于頭面頸部、四肢等體表部位[1]。Mulliken 和Glowacki[2]根據病史、瘤體生長情況及內皮細胞等特征將其分為血管瘤和血管畸形(vascular malformation)，并且根據內皮細胞生長、肥大細胞計數以及纖維細胞形成等將血管瘤分為增殖期(proliferating phase)、消退期(involuting phase)、消退后期( involuted phase) 3個階段，其中相當一部分血管瘤可以自然消退。但其消退的機制尚不清楚，臨床難以預先判斷其是否能夠消退及其危害性。由于對血管瘤生物學特性認識不清，尚難以發現其規律，因此對血管瘤的研究一直是熱點。為探求其生物學特性，有人設計了用裸鼠作載體，移植人體血管瘤，建立動物模型[3]。但是如何尋找其最佳的模型建立條件，是我們所要探求的。

1材料和方法

1.1人體血管瘤標本來源:瘤體組織標本來源于我科1 例近期瘤體生長迅速的5個月女性患兒手腕部的增生期血管瘤。病理學檢查光鏡下見腫瘤組織位于真皮層內，無明顯包膜，由大小不等的變形毛細血管內皮細胞及其形成的管腔構成，腔內可見紅細胞，局部有的內皮細胞成團，尚無管腔形成。

1.2實驗動物分組及飼養:裸鼠(BALB/c nude mice) 20 只，雌雄不限，鼠齡20～24天，體重18～21g，隨機分成4組，每組5 只，一組為單純接種組，剩下3組為雌激素作用組。實驗1組在移植后給予普通鼠食喂養;實驗2組在1組基礎上每周肌肉內注射雌二醇(SIGMA，美國)1次，每次0.01 mg，共12次;實驗3組在1組基礎上每周肌肉內注射雌二醇1次，每次0.1 mg，共12次;實驗4組在1組基礎上每周肌肉內注射雌二醇1次，每次1mg，共12次。每只動物均獨籠飼養，普通鼠食喂養。裸鼠由第四軍醫大學實驗動物中心提供及飼養。

1.3動物模型的建立:在無菌條件下手術切除患兒血管瘤組織，切成4mm×3mm×3mm 的小塊，用PBS液漂洗3次，分別經皮膚切口置入所有實驗裸鼠頸部兩側及左側臀部皮下和右側腹股溝處，每只4 處。移植工作在標本離體后1h內完成。

1.4腫瘤的生長觀察及測量:每周定期觀察裸鼠及移植瘤生長情況。于接種后15天、30天、60天、90天分別用游標卡尺測量腫瘤最大直徑a 及橫徑b，根據公式V =π/6×a×b2粗略估算腫瘤體積變化。

1.5病理組織學觀察及免疫組化檢測:各組實驗鼠均于移植后第30、60、90天切取移植瘤。HE染色，光鏡觀察。以裸鼠肌肉組織切片的CD31、CD34標記為陰性對照，行移植瘤切片免疫組化的陽性細胞計數，計算每個瘤組織CD31、CD34的陽性指數。每張切片在400倍光學顯微鏡下隨機選取10個視野，每個視野統計100個細胞中的陽性細胞數，其總數除以10，再乘100%，即為其陽性指數。CD31、CD34由西安壯志生物技術有限公司提供(abcam，英國)。

1.6統計學處理:實驗數據用SPSS12.0(SPSS Inc. Chicago， Illinois)統計軟件處理，采用方差分析，P﹤0.05，有顯著性差異。

2結果

2.1 裸鼠及移植瘤的生長特點:飼養90天，所有裸鼠均存活。實驗1組(單純瘤體移植組)1個月后所有移植瘤組織體積都不同程度地變小，到90天時有9處完全吸收消失，其余11處均不同程度地變小、硬化、消退。實驗2組(低劑量0.01mg組)植入后瘤體也有不同程度的變小，90天后也有部分變小、消退。實驗3組(0.1mg組)與實驗4組(1mg組)1個月后都有增大，但是實驗4組有部分瘤體增長速度過快而發生潰破，最終纖維化，消失。實驗3組瘤體穩定的逐漸變大。(表1，圖1)

2.2 光鏡下瘤體病理學檢查:移植后30天，實驗1組已可見少量纖維組織和吞噬細胞，部分纖維組織分隔瘤組織成小葉狀，可見間質細胞。其余三組可見含有較多單層細胞的毛細血管腔。移植60天后，實驗1組已無明顯的血管腔樣結構，多被纖維結締組織和脂肪組織替代;實驗2組也可見纖維結締組織和脂肪組織。其余兩組可見增生活躍的內皮細胞，細胞體積不規則，形成較多含單層內皮細胞的毛細血管腔和血竇。但實驗4組，既1mg組，部分瘤體增殖過快，發生潰破;其余瘤體內皮細胞增殖活躍，有血竇樣結構生成，內含大量紅細胞。移植90天后，實驗1、2組大部分瘤體消失，剩余全部纖維化。實驗3組細胞間質和血管內皮細胞都增多，毛細血管管腔密集，有大量血竇生成，內可見紅細胞(圖2)。實驗4組部分潰瘍后遺留纖維結締組織，其余瘤體情況同實驗3組。

2.3移植瘤免疫組化檢測

2.3.1CD31在30天時，在各組都有陽性表達。60天時，實驗1組與2組表達率下降，實驗3組與4組表達率升高。90天時，實驗1組無瘤組織，實驗2組殘留組織幾乎沒有表達;實驗3組陽性細胞表達依然很高，實驗4組剩余瘤組織陽性細胞表達同樣較高。作為對照的裸鼠肌肉組織CD31表達為陰性。(表2，圖3)

2.3.230天時CD34在各組都有明顯的表達。60天后實驗1組和2組表達陽性細胞數明顯下降，實驗3組和實驗4組中正常瘤組織陽性細胞數表達升高。90天時實驗1組已無瘤組織，實驗2組剩余瘤組織表達很低;實驗3組仍然呈強陽性表達，實驗4組剩余瘤組織也有較強表達。(表3，圖4)

3討論

人們很早就觀察到皮膚血管瘤的生長與雌激素水平有關，近期研究發現增殖期血管瘤中雌激素和雌激素受體(ER)都比消退期要高很多[4-5]。Sasaki 等[6]發現，嬰幼兒增殖期血管瘤患兒血漿雌二醇水平較正常同齡兒高出4倍，且瘤組織中ER 顯著高于正常皮膚血管組織。Khalid等[7]用免疫組化法證實增生的毛細血管瘤內皮細胞和腫瘤血管組織中雌激素受體相關抗原ER-D5表達增高。此后，一些學者就血管瘤中ER的表達做了免疫組化研究。目前認為，血管瘤是雌激素的靶組織之一，雌激素和ER在血管瘤的發生發展中可能產生某種重要作用[8-9]。大量的體內外實驗發現，雌激素與一些腫瘤的血管生成密切相關，并且其促血管生成作用主要通過上調VEGF、bFGF 的表達，使兩者協同來實現[10]。如乳癌、子宮內膜異位癥中，雌激素能通過上調VEGF 基因的表達增強其血管生成作用[11-14]。Hyder等[15]發現，VEGF基因上有2個核苷酸序列與ER 基因中的雌激素反應元件高度同源，分別位于VEGF基因的5'和3'非翻譯區，這2個序列可與ER 特異地結合，雌激素即可與ER結合影響VEGF的表達。雌激素作為一種促有絲分裂原，能與胞核內的ER結合，發生構象改變，作用于轉錄輔助因子，導致特異性基因轉錄水平的變化，促進細胞DNA、RNA 和蛋白質合成，刺激細胞分裂增殖[16-17]。但雌激素在血管瘤生長機制中所起的作用一直不明，有的學者認為雌二醇在有細胞生長因子(如血管內皮因子，或纖維細胞生長因子)共同存在的條件下，對血管內皮細胞繁殖有促進作用[18]，但作用機制尚不明確。

目前對血管瘤的研究，大部分是建立在對離體人血管瘤標本的研究基礎上。近年來，隨著實驗動物學的發展，逐步建立起各種血管瘤的實驗動物模型。有的是利用動物身體上某一特殊部位與毛細血管形態和結構的相似性來進行研究。應用最多的是利用雞的雞冠和肉垂。有的是利用實驗動物的肝、脾組織存在大量血竇和內皮細胞的特點，作為海綿狀血管瘤的動物模型。有學者[19]應用DNA顯微注射法，將 Py-MT基因導入小鼠受精卵，并植入母鼠輸卵管。結果在62只新生小鼠中得到1只具有血管瘤樣表型的小鼠。該小鼠的唇、舌、掌心、皮膚及胃黏膜表面均可見有血管樣異常增生物。增生物經組織學檢查為一些有扁平細胞襯里的充滿血的海綿狀囊腔結構，類似于海綿狀血管瘤的組織學表現。還有利用細胞懸液接種的辦法制作血管瘤裸鼠模型[20]等。研究表明，雌激素可使實驗動物的血管床明顯充血，促進移植物毛細血管及營養血管的形成。體內高水平的雌激素可能通過相應受體刺激內皮細胞的增殖和血管的充血，來影響血管內皮細胞的生長[21]。同時，雌激素也可以直接作用于血管，使微血管擴張，血管床容量增加，從而促進移植瘤的成活。

研究人血管瘤的機制和防治方法，我們需要所用模型中血管瘤生長特點與人體血管瘤的自然生長過程相似，腫瘤表達穩定移植瘤在動物體內可持續繁殖和存活，移植瘤的形態、功能與原人體腫瘤保持一致及移植瘤來源于人體而非動物自身的誘發瘤。研究發現血管瘤內皮細胞可表達多種特異性的內皮標志，如 CD31、CD34、VWF等[22-23]。其中CD31、CD34是微小血管內皮細胞的特異性標志物，在毛細血管瘤內皮細胞中為高表達。我們用鼠抗人的CD31、CD34單克隆抗體檢測移植后血管瘤組織，結果增殖的移植瘤中呈強陽性表達(檢測移植前的原供體血管瘤組織，也呈強陽性表達)，而消退的組織中表達明顯下降，而在作為陰性對照的裸鼠肌肉組織表達為陰性，證明其內皮細胞來源是人而不是裸鼠。

我們在彭強等[3]人血管瘤動物模型的建立方法的基礎上，探尋最佳的雌激素用量，探討血管瘤裸鼠模型建立的最佳條件。試驗中使用雌激素后我們發現相對于未使用雌激素的移植物增殖迅速，但是移植物的增殖對于雌激素的劑量還是存在依賴性，不使用或使用雌激素劑量過低不能夠有效的維持移植物的增殖;早期各組移植物內皮細胞都有壞死和凋亡的情況， 30天后，無雌激素和低劑量雌激素組可以觀察到移植物中有大量的纖維結締組織增生，血管內皮和血管管腔樣結構消失，血管閉塞，同時還有大量的巨噬細胞浸潤，免疫組化檢測發現CD31、CD34陽性表達的細胞數量明顯減少。其它兩組內皮細胞在壞死和凋亡后又迅速的增殖，出現大量無規則的紊亂的內皮細胞和管腔樣結構，還可見有血竇樣結構，內充斥有紅細胞;CD31、CD34免疫組化檢測發現表達陽性的細胞大量增生，有成團聚集的傾向。但同時我們也發現如果雌激素用量過大，會出現部分瘤體生長迅速并發生潰破、壞死;在1mg組(既實驗4組)觀察到壞死的移植物潰破到表皮形成潰瘍樣的結構。我們認為是由于過量雌激素刺激使移植物增殖過快，而血供難以跟上而發生移植物的壞死。在制作模型過程中適當的應用雌激素，可以維持并且促進移植物的生長，血管內皮細胞和血管管腔樣結構也增多，有血竇樣結構生成，內可見有紅細胞聚集;免疫組織化學檢測顯示CD31、CD34陽性表達的細胞明顯增多。其生物學特性和患者的增殖期血管瘤的生物學特性相似，我們可以用該模型來研究血管瘤的防治和機理。

本實驗進一步摸索了裸鼠血管瘤移植模型制作的最佳條件。在適當的外來雌激素的干預下，移植腫瘤表達穩定，有增殖性，同時載瘤小鼠生長良好。而建立的移植瘤模型能夠存在足夠的時間，為進一步研究血管瘤的生物學特點及其生長轉歸機制，以及利用它進行血管瘤防治的臨床研究提供了很好的條件。

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[收稿日期]2009-10-26[修回日期]2010-01-12

編輯/張惠娟