丹參多酚酸鹽對大鼠腦缺血再灌注過氧化損傷的保護作用

【摘要】 目的 觀察丹參多酚酸鹽對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織內SOD、GSHPx和MDA含量的影響，探討其缺血腦保護的作用機制。

方法線栓法制作大鼠中動脈缺血再灌注損傷模型。SD大鼠隨機分為正常對照組、缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽低劑量治療組（10 mg/kg）和丹參多酚酸鹽高劑量治療組（30 mg/kg）。各組動物按要求給藥，在預定時間進行神經損傷行為學評分、腦梗死體積及腦組織內超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性和丙二醛（MDA）含量的測定。結果 與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸鹽治療組大鼠神經損傷行為學評分及腦梗死體積減少，腦組織內SOD、GSHPx活性升高，MDA含量下降，均具有統計學意義(P＜0.05)，且呈劑量依賴性。結論丹參多酚酸鹽可通過抑制脂質過氧化反應，保護抗氧化酶的活性，從而介導神經保護作用。

【關鍵詞】 丹參多酚酸鹽；腦缺血再灌注；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；丙二醛

文章編號：1003-1383(2010)06-0665-03 中圖分類號：R 743文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.06.005

The effect of salvianolate on the peroxidation injury induced by focal

cerebral ischemia reperfusion in rats

WANG Qiang1，ZHANG Yi1，LI Lu2，DONG Bo1，YANG Yilin1

(1.Department of Neurosurgery，2.Department of Clinical Laboratory，

Changzhou First People's Hospital，Changzhou 213003，China)

【Abstract】 ObjectiveTo study the protective effect of salvianolate on the peroxidation injury induced by focal cerebral ischemia reperfusion in rats and to reveal the mechanism.

Methods 48 SD rats were divided into four group randomly，they are normal control group，ischemia reperfusion group，salvianolate (10 mg/kg) group and salvianolate(30 mg/kg)group.Each group contained 12 rats.The Longa method was used to establish the MCAO model.The salvianolate at different dose were injected intraperitoneally at different time point according to the test design. The brain infarct volume by TTC stain and behavior scores by Bederson's methods were also determined in order to evaluated the protective effect.Also we use assay kit to determine the activities of SOD and GSHPx，content of MDA in each group.

Results Comparing with the ischemia reperfusion group， brain infarct volume and behavior score of salvianolate group was lower，the activities of SOD and GSHPx of brain tissue increased，the content of MDA decreased.There was significant difference between them(P＜0.05)，the effect of salvianolate was dosedependent.

Conclusion The salvianolate plays neuroprotective effect by inhibiting the lipid peroxidation and protect the activity of antioxidant enzyme.

【Key words】salvianolate；cerebral ischemia reperfusion；SOD；GSHPx；MDA

大量證據表明氧自由基引起的脂質過氧化是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一。缺血再灌注可使自由基連鎖反應激化，大量的自由基引起細胞膜脂質過氧化，導致神經元死亡，造成嚴重的神經功能損害。丹參是一種傳統的活血化瘀中藥，在臨床上被廣泛用于治療冠心病、心絞痛、缺血性中風等疾病，丹參多酚酸是其最重要的有效成分［1］。已有實驗證實丹參多酚酸對實驗性腦缺血具有顯著的保護作用［2］，但其機制尚不明確。本研究在建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型基礎上，觀察再灌注后大鼠神經功能、腦梗死體積及缺血腦組織內SOD、GSHPx和MDA的變化，探討丹參多酚酸鹽對局灶性腦缺血再灌注的保護作用及其機制。

材料和方法

1.動物及試劑 SD大鼠購自蘇州大學實驗動物中心。注射用丹參多酚酸鹽（中國上海綠谷藥業，批號20070101），SOD、GSHPx、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，氯化三苯基四氮唑（TTC）購自北京化學試劑公司，其它試劑均為國產分析純。

2.動物分組及模型制作 成年雄性SD大鼠48只，體重230～250 g，隨機分為正常對照組、缺血再灌注組、丹參多酚酸鹽低劑量組（10 mg/kg）及丹參多酚酸鹽高劑量組（30 mg/kg），每組12只。參照Longa［3］法，制作大鼠MCAO模型。大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（45 mg/kg），頸部正中切口，分離左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。結扎CCA近心端、ECA起始端后，翼腭動脈短暫夾閉以防誤插，經CCA插入線栓（線栓為直徑0.23 mm進口魚線，頭端涂抹石蠟［4］），插入深度由分叉部記(18.0±0.5)mm。再灌注處理為拉線栓使線頭退至頸外動脈。術中維持肛溫(37±0.5)℃；缺血時間2 h，再灌注72 h。在缺血期間及再灌注后2 h保持體溫在（37±0.5）℃。丹參低劑量組及高劑量治療組在術后60 min、術后第1 d及第2 d，分別將10 mg/kg及30 mg/kg的丹參多酚酸鹽溶于生理鹽水中，腹腔注射；正常對照組和缺血再灌注組腹腔注射等量的生理鹽水。模型成功的標志為大鼠手術麻醉清醒后出現左側肢體癱瘓，站立不穩，提尾時向一側轉圈。

3.神經功能缺損評分 各組動物于蘇醒后6 h內按照Zea Longa和Bederson的方法進行評分，0分：無神經缺損癥狀；1分：右前肢不能完全伸直；2分：向右側旋轉；3分：向右側傾倒；4分：不能自己行走或昏迷。評分為0分、有呼吸困難、提前死亡及處死后發現有蛛網膜下腔出血的均棄之不用，手術中出血過多的大鼠亦予以剔除，并均在后續實驗中補足。建模成功大鼠缺血后24 h再次評分，將此分數錄入實驗結果。

4.腦梗死體積的測定 每組隨機選擇6只大鼠，適時斷頭取腦，棄去嗅球、小腦及低位腦干。置-20℃冰箱中冷凍20 min，距額極3 mm開始切片，每片厚2 mm，放入1％TTC水溶液中，37℃孵育30 min。缺血區染成白色，有正常血供的腦組織為紅色。染色后以10%甲醛溶液避光保存24小時，數碼相機拍照后，應用病理圖像分析儀測定梗死面積，根據公式V=（A1+…+An）t/2算出梗死體積，其中t為切片厚度，A為梗死面積。

5.指標測定 大鼠戊巴比妥鈉麻醉后斷頭處死，冰盤上快速取左側額頂葉背外側區皮質，精確稱重后用預冷的勻漿介質制成10％腦勻漿。低溫高速離心15 min，取上清-70℃冰箱保存。嚴格按照試劑盒說明進行SOD、GSHPx活性及MDA含量測定。

6.統計學分析 結果用均數±標準差(-±s)表示，采用SPSS12.0統計軟件包，以單因素方差分析和t檢驗作差異的顯著性分析。P＜0.05表示有統計學意義。

結果

1.行為學評分 與缺血再灌注組比較，丹參多酚酸鹽可以明顯降低實驗大鼠的行為學評分，且高劑量組降低程度較低劑量組更為顯著(P＜0.05）。見表1。

2.腦梗死體積 與缺血再灌注組比較，丹參多酚酸鹽可以明顯減少實驗大鼠的腦梗死體積，且高劑量組較低劑量組更為顯著 (P＜0.05)。見表1。

3.丹參多酚酸鹽對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織SOD、GSHPx和MDA的影響缺血再灌注后腦組織內SOD及GSHPx活性降低，MDA含量明顯升高；丹參多酚酸鹽可提高SOD及GSHPx活性，降低MDA含量，且高劑量組與低劑量組間有顯著性差異 (P＜0.05)。見表2。

討論

缺血性腦血管病是臨床常見的致死性疾病之一，對人類健康危害極大。腦缺血再灌注損傷的病理生理機制非常復雜，再灌注期產生的大量自由基導致的過氧化反應已被證實參與了腦損傷的發生。自由基是帶有不成對自由電子的化學基團，性質異常活躍，易與脂質、蛋白質、核酸發生一系列過氧化反應。其既可通過損傷大分子物質導致缺血性腦損傷，也能通過信號轉導途徑損傷腦組織。SOD和GSHPx是細胞內兩種主要的抗氧化酶，可增加自由基的清除，它們是體內自由基平衡的酶性調節劑，可調動或激活機體中的內源性抗氧化系統，有利于預防或減輕自由基損傷，也是較敏感并能反映細胞抗氧化能力的觀察指標。MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化作用而形成的脂質過氧化物，它的量反映了體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷程度。

研究證實，減少自由基的產生或增強清除自由基的能力，能產生腦保護作用［5］。本研究顯示丹參多酚酸鹽使SOD和GSHPx活性的下降趨勢得到了明顯改善，腦組織中SOD和GSHPx的活性增加，同時MDA的含量也明顯降低。說明丹參多酚酸鹽能改善機體氧自由基生成與清除之間的動態平衡，增強機體的抗氧化能力，一方面增強了腦組織清除氧自由基的能力，同時也能減輕MDA引起的損傷，這是其發揮缺血腦保護作用的機制之一。

丹參多酚酸鹽能提升組織中SOD 和GSHPx的活性的具體機制尚不清楚，但可能與其能清除體內自由基有關。有研究發現靜脈應用丹參后，左半結腸癌切除術后患者血中SOD活性明顯上升，同時自由基含量也明顯減少［6］。王舒平等［7］證實了丹酚酸能清除實驗小鼠體內自由基。自由基被清除后，SOD和GSHPx的消耗大大減低，從而間接提高了SOD和GSHPx的活性，增強了腦組織抗自由基損傷的能力，發揮腦保護作用。

參考文獻

［1］劉艾林，李銘源，王一濤，等.丹參藥理學活性物質基礎研究現狀［J］.中國藥學雜志，2007，42(9):641-646.

［2］蔣玉鳳，王秋華，劉志勤，等.丹酚酸B對缺血小鼠腦能量代謝和腦水腫的影響［J］. 中國病理生理雜志，2007，23（12）:2300-2303.

［3］Longa EZ， WeinsteinPR， Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20(1):84-91.

［4］楊 濤，劉 勇，常燕群.線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的改進及評價［J］．中國臨床康復，2006，10(30)：171-173.

［5］王晶余，許建華，徐忠信.針刺誘導腦缺血耐受與GDNF表達的研究［J］．中國實驗診斷學，2008，12(12)：1580-1581.

［6］李德祥，陳 超，王治偉，等.丹參對梗阻性左半結腸癌一期切除術后患者自由基水平的影響［J］．中國普通外科雜志，2008，17(4)：400-401.

［7］王舒平，王艷艷，尹彩娜，等.丹酚酸B對高糖日糧小鼠消化系統自由基水平的影響［J］．天然產物研究與開發，2009，21(6)：948-951.

(收稿日期：2010-09-08 修回日期：2010-12-03)

(編輯：潘明志：英文審校：鐘京梓)

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