RP-HPLC測定板藍根顆粒中靛玉紅的含量

【摘要】:目的:建立板藍根顆粒中靛玉紅的含量測定方法，為板藍根顆粒的質量標準控制提供理論依據。方法:采用LC-10ATvp高效液相色譜儀，色譜柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm，10μm);流動相:甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27);流速:1.0ml/min;檢測波長:289nm;柱溫:25℃;進樣量:20μl。結果:靛玉紅進樣量在5.28～26.40μg范圍內與峰面積呈良好線性關系，R=0.9935;平均回收率為100.67%，RSD=1.31%。結論:本實驗所建立的方法專屬性強，準確度高，重現性好，可作為板藍根顆粒的質量控制方法。

【關鍵詞】:RP-HPLC;板藍根顆粒;靛玉紅

【中圖分類號】R927.1【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)06-078-2

Study on Content Measurement of Indirubin in Banlangen Granules by RP-HPLC

【Abstract】:Objective:To establish a method for extracting of measuring the content of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC，in order to provide theoretical basis for the quality standards of banlangen granules. Methods:The content measurement of indirubin in banlangen granules by RP-HPLC，LC-10ATvp high-performance liquid chromatograph，Columns Diamonsil - C18(4.6mm×150mm，10μm)，mobile phase:methanol:0.2% acetic acid solution(73:27);flow rate:1.0ml/min;detection wavelength:289nm;column temperature:25℃;injection volume 20μl. Results:The indirubin within the range of 5.28～26.40μg peak area was linear，R=0.9935;The average recovery was 100.67%，RSD=1.31%. Conclusion:The established method has strong specificity，high accuracy and good reproducibility，it can be used as quality control of banlangen granules.

【Key words】:RP-HPLC;Banlangen Granules; indirubin

板藍根顆粒是以十字花科植物菘藍(Isatisindigotica

Fort)為原料制成的單味制劑，為《中國藥典》(2005版)收載品種，具有清熱解毒，涼血利咽，消腫的功效，而靛玉紅是板藍根中抑菌的主要活性成份，尤其靛玉紅是板藍根中治療慢性粒細胞白血病的有效成份之一[1-2]。臨床用于治療肺胃熱盛所致的咽喉腫痛，口咽干燥，腮部腫脹，急性扁桃體炎，腮腺炎，防治傳染性肝炎，小兒麻疹等病癥[3-4]。

1儀器和試藥

1.1主要儀器LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津)，SPD-10A檢測器(日本島津)，FA1004型電子天平(上海精科天平儀器廠)，KS-600D超聲波清洗機(寧波海曙科生超聲設備有限公司);ZK-82A型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠);TDL-40B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)。

1.2試藥對照品靛玉紅(中國藥品生物制品檢定所，批號200204);甲醇為色譜純，氯仿為分析純，水為蒸餾水;板藍根顆粒為市售(山西康意制藥有限公司生產，批號為20080802、20080803、20080805)、(安徽華佗國藥廠生產，批號為20080419、20080420、20080421)。

2方法與結果

2.1對照品溶液的制備精密稱取靛玉紅對照品6.6mg于50ml容量瓶中，加甲醇適量至刻度線，超聲15min，制備成濃度為0.132mg/ml的對照品溶液，放入-4℃冰箱貯存，備用。

2.2樣品溶液的制備稱取板藍根顆粒適量，研細，稱取1g置具塞錐形瓶中，加氯仿50ml，超聲處理20分鐘，80℃水浴回流60分鐘，過濾，將濾液蒸干，殘渣用甲醇定量移至10ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。

2.3色譜條件與系統適用性試驗[4]色譜柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm，10μm);流動相:甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27);流速:1.0ml/min;檢測波長:289nm;柱溫:25℃;進樣量:20μl。在此色譜條件下，靛玉紅色譜峰達到基線分離。

2.4線性關系的考察分別精密吸取對照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml置于10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度線，搖勻，配制成不同濃度的對照品貯備液，分別精密吸取上述對照品貯備液20μl，分別進樣測定，以峰面積為縱坐標(Y)，以質量濃度(μg/ml)為橫坐標(X)進行線性回歸，得到線性方程為:Y=244332X-133383，R=0.9935，靛玉紅進樣量在5.28～26.40μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5精密度實驗按“2.1”項下方法配制對照品溶液(質量濃度為15.84μg/ml)，精密吸取20μl，重復進樣5次，

結果靛玉紅峰面積的RSD=1.49%(n=5)，表明儀器精密度良好。

(下轉第80頁)

(上接第78頁)

2.6穩定性試驗精密吸取同一樣品溶液適量，在室溫下放置，在0，5，10，12，24小時分別進樣，測定峰面積。結果RSD=1.64%(n=5)，表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7重復性實驗取同一批號的板藍根顆粒樣品5份，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算靛玉紅的含量。結果靛玉紅含量的RSD=

0.52%，表明本實驗方法重現性良好。

2.8加樣回收率試驗精密稱取已知含量的板藍根顆粒樣品粉末6份適量，分別加入靛玉紅對照品適量，置具塞錐形瓶中，按“2.2”項下方法制備溶液，按上述色譜條件測定，平均回收率為100.67%，RSD=1.31%(n=6)。表明本方法的回收率較好，結果見表1。

2.9樣品含量測定取不同批號板藍根顆粒樣品，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，按上述設定的色譜條件測定樣品中靛玉紅的含量，平均含量分別為60.40μg/袋、61.25μg/袋、60.75μg/袋、57.10μg/袋(n=5)。

表2 板藍根顆粒中靛玉紅含量測定結果(n=5)

批號樣品中靛玉紅含量(μg/g)樣品中靛玉紅含量(μg/袋)

2008080212.0860.40

2008080312.2561.25

2008080512.1560.75

2008041911.4257.10

2008042011.9459.70

2008042111.8459.20

3討論

由于板藍根顆粒中的靛玉紅含量非常低，為使靛玉紅從顆粒劑中充分溶解提取出來，我們在實驗中曾試用過以下方法提取制備供試品溶液:①50ml熱水溶解后用氯仿萃取4次，每次30ml;②40ml熱水溶解加入20ml飽和無水硫酸鈉溶液后用乙醚萃取4次，每次40ml;③浸泡15小時，用索氏提取器回流提取8小時;④用乙酸乙酯回流2個小時。經測定上述方法提取的溶液，靛玉紅含量均較低;經分析改進，采用氯仿作溶劑超聲處理20分鐘后回流60分鐘。該方法提取的板藍根顆粒中的靛玉紅較為完全，且操作簡單易行。

試驗中曾試用過多種流動相，如甲醇:水(62:38)，甲醇:水(75:25)，甲醇:0.1%醋酸溶液(73:27)，甲醇:0.1%磷酸溶液(60:40)等，以本文所述流動相，即甲醇:0.2%醋酸溶液(73:27)，分離效果最佳，且出峰穩定，峰形較好，保留時間適宜。

本實驗所測定的二個廠家生產的板藍根顆粒中靛玉紅的含量相差不大，說明該實驗所用的方法對這二個廠家的板藍根顆粒中靛玉紅的含量測定具有可行性。

總之，通過本實驗建立了板藍根顆粒中靛玉紅含量測定的RP-HPLC測定方法，該法操作重復性良好，測定結果穩定可靠，因此，該方法能應用于板藍根顆粒的質量控制。

參考文獻

[1] 安益強，賈曉斌，陳彥等.RP-HPLC測定不同廠家板藍根顆粒中表告依春的含量[J].中華中醫藥雜志，2009，24(4):529-531.

[2] 陳勇，李祥，陳建偉，等.HPLC法測定板藍根顆粒中直鐵線蓮寧B和異落葉松脂素的含量[J].現代中藥研究與實踐，2009，22(6):53-55.

[3] 李向陽，屠萬倩，李振國，等.HPLC法測定復方板藍根顆粒中靛玉紅的含量[J].中醫研究，2005，18(7):18-19.

[4] 程力惠.板藍根中靛玉紅提取方法研究[J].亞熱帶植物科學，2005，34(2):46-47.