蝮蛇蛇毒中小分子肽抑制血小板聚集作用的研究

【摘要】:目的:研究華南地區(qū)蝮蛇粗毒中分離得到的蛇毒多肽AHP-4的抑制血小板聚集作用。方法:分別用二磷酸腺苷、膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)兔血小板聚集，觀察不同劑量的AHP-4對(duì)血小板聚集的抑制率，并計(jì)算IC50。結(jié)果:AHP-4在體外可劑量依賴性地抑制由二磷酸腺苷、膠原和花生四烯酸誘導(dǎo)的兔血小板聚集，其IC50分別為25.4nM、256.6nM、11.2nM。結(jié)論:從AHP-4對(duì)這三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的體外兔血小板聚集的作用來看，其作用機(jī)制可能如下:阻斷二磷酸腺苷與二磷酸腺苷受體的結(jié)合;抑制花生四烯酸的代謝產(chǎn)物的生成;抑制血小板膜上磷脂酶的激活。

【關(guān)鍵詞】:蝮蛇蛇毒;血小板聚集;二磷酸腺苷;膠原;花生四烯酸

【中圖分類號(hào)】R222.16【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8517(2010)06-013-2

血小板聚集在血栓形成的過程中起著關(guān)鍵作用，因此，抗血小板聚集藥物成為治療血栓疾病藥物的重要組成部分。目前，已從蛇毒中分離純化得到了多種具有抑制血小板聚集作用的蛋白組分，但至今未有蛇毒蛋白組分作為藥物進(jìn)入臨床。本研究以華南地區(qū)蝮蛇粗毒分離得到的分子量為7554Da的AHP-4蛇毒多肽為樣品[1]，對(duì)其抗血小板聚集的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1實(shí)驗(yàn)材料和儀器

本實(shí)驗(yàn)室分離純化的蛇毒多肽AHP-4[1][2]，二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP，美國sigma公司)，膠原(collagen，COL，自制)，花生四烯酸(arachidonic acid，AA，美國sigma公司)，枸櫞酸鈉(光華試劑廠)，0.9%生理鹽水(昆明市宇斯藥業(yè)有限責(zé)任公司)，新西蘭家兔♀♂不限，體重(2.52±0.42kg)(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，離心機(jī)LXJ-Ⅱ(上海醫(yī)用分析儀器廠)，玻璃微量進(jìn)樣器0-50μl(上海醫(yī)用激光儀器廠)，硅化加蓋試管10ml(五洲醫(yī)用塑料廠)，比濁管(北京普利生公司)，小磁棒(北京普利生公司)，LBY-NJ血液凝聚儀(北京普利生公司)。

2方法

2.1膠原的制備[3]取剃毛后的一塊大鼠皮膚，剪碎，按濕重每0.1g加入1ml生理鹽水，磨成勻漿，以3000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，吸取上清液，放置冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2血小板誘導(dǎo)劑的濃度ADP誘導(dǎo)血小板聚集的終濃度為17.65μM，膠原血小板聚集的終濃度是4.8μg/ml，AA誘導(dǎo)血小板聚集的終濃度是14.70μM。

2.3AHP-4的實(shí)驗(yàn)濃度AHP-4的濃度分別配制成8nM、16nM、32nM、64nM、138nM，276nM和552nM備用，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板聚集的實(shí)驗(yàn)，需選擇AHP-4的不同濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。AA和ADP作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板聚集時(shí)，AHP-4選用的濃度是8nM、16nM、32nM、64nM、138nM;在COL誘導(dǎo)血小板聚集實(shí)驗(yàn)，AHP-4選用的濃度是32nM、64nM、138nM，276nM和552nM。

2.4血小板實(shí)驗(yàn)新西蘭家兔耳中動(dòng)脈穿刺取血9ml，與3.8%枸櫞酸鈉混合(9:1，V/V)，室溫下800r/min離心10min，取上層血漿，即為富血小板血漿(platelet2rich plasma，PRP)，下層紅細(xì)胞3000r/min離心10min，上清液為貧血小板血漿(platelet poor plasma，PPP)。血小板聚集實(shí)驗(yàn)在LBY-NJ的血小板聚集儀上進(jìn)行。以PPP調(diào)PRP使透光度在30左右(血小板數(shù)在2×109/ml)。分別取200μl調(diào)過的PRP與40μl不同濃度的樣品或生理鹽水于比濁管中37℃下孵育至少5min，在電磁攪拌下分別加入致聚劑ADP10μl(終濃度300μmol/L)，膠原10μl(終濃度4.8μg/ml)，花生四稀酸(終濃度14.70μmol/L)誘導(dǎo)血小板聚集，觀察樣品對(duì)血小板聚集的影響，比較空白PRP與樣品PRP在3min內(nèi)最大聚集程度，計(jì)算聚集百分率和樣品抑制聚集百分率。

2.5數(shù)據(jù)處理

血小板聚集抑制率=[(對(duì)照聚集%-藥物聚集%)/對(duì)照聚集%]×100%。用Origin6.0統(tǒng)計(jì)軟件作出劑量依賴曲線。50%聚集抑制劑量(50percent inhibitory on centration，IC50)用直線回歸方程求出。

3結(jié)果

3.1AHP-4對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的活性作用，IC50是25.4nM。

圖1 劑量依賴方式一致ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集

Fig1 Inhibition of platelet aggregation induced by ADP in dose-dependent manner

3.2AHP-4對(duì)膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的活性作用，IC50是256.6nM。

圖2 劑量依賴方式一致COL誘導(dǎo)的兔血小板聚集

Fig2 Inhibition of platelet aggregation induced by COL in dose-dependent manner

3.3AHP-4對(duì)AA誘導(dǎo)的血小板聚集的活性作用，IC50是11.2nM。

圖3 劑量依賴方式一致AA誘導(dǎo)的兔血小板聚集

Fig3 Inhibition of platelet aggregation induced by AA in dose-dependent manner

4討論

本文首次對(duì)從中國大陸華南地區(qū)的蝮蛇蛇毒中分離出一種新的蛇毒多肽AHP-4的抑制血小板聚集的作用進(jìn)行了研究，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本研究以ADP、AA和COL作為血小板聚集的誘導(dǎo)劑，研究了AHP-4的抗血小板作用。從血小板的抑制率來看，無論是哪種誘導(dǎo)劑，AHP-4對(duì)血小板聚集的抑制作用呈劑量依賴關(guān)系，亦即AHP-4濃度越高，對(duì)血小板聚集的抑制作用就越強(qiáng)。上述結(jié)果表明AHP-4在體外可劑量依賴性地抑制由AA、ADP、膠原誘導(dǎo)的兔血小板聚集，其IC50分別為11.2nM、25.4nM、256.6nM，其效應(yīng)的強(qiáng)度是AA>ADP>COL。說明AHP-4對(duì)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集作用有一定差異。

上述三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板聚集的機(jī)理及方式有所區(qū)別，ADP與血小板膜上的ADP受體結(jié)合，引起血小板的變形、聚集，最后促進(jìn)TXA2的形成;AA在環(huán)氧合酶的作用下，生成不穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)過氧化物，通過血小板中的TXB2的合成酶催化變成TXA2;膠原的作用機(jī)制則是通過激活血小板膜上的磷脂酶，分解磷脂酶后釋放出AA。

因此，從AHP-4對(duì)這三種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的體外兔血小板聚集的作用來看，其作用機(jī)制可能如下:阻斷ADP與ADP受體的結(jié)合;抑制花生四烯酸的代謝產(chǎn)物的生成;抑制血小板膜上磷脂酶的激活。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳少瑜，王廣發(fā)，呂琳等.一種新的蝮蛇蛇毒蛋白組分的分離純化及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用[J].中藥材，2009，32(12):1878-1880.

[2] 馬安德，吳少瑜，張嘉杰等.一種新的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物的分離純化及其氨基酸序列分析[J].中藥材，2006，29(2):132-134.

[3] 徐理納.血小板聚集性測定方法藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法(第三版)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，1998.9.