植物WRKY轉錄因子的結構特點及其在植物防衛反應中的作用

摘要:綜述了WRKY轉錄因子的發現、結構特點、表達特點以及WRKY轉錄因子在各種植物防衛反應中的調控作用，指出WRKY轉錄因子是一類參與多種脅迫反應的誘導型轉錄因子，其N-端具有WRKYGQK高度保守的氨基酸序列，能夠與基因啟動子中的(T)(T)TGAC(C/T)序列(W盒)發生特異性結合，從而調節基因的表達，參與植物的各種生長和發育過程。

關鍵詞:WRKY 轉錄因子;W盒;脅迫;防衛反應

中圖分類號:Q945.78文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.02.007

Structure of Plant WRKY Transcription Factors and Their Roles in Plant Defense Responses

JIA Cui-ling，HOU He-sheng

(College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian， Liaoning 116029，China)

Abstract:The structure features and expression regulation of WRKYs，and the regulatory roles of the transcription factors in the plant defense responses were emphasized in the paper. It indicated that WRKY transcription factors were a group of inducible transcription factors which were involved in a variety of stress responses. There was a conserved WRKYGQK amino acids sequence in N-terminal of the proteins. WRKY transcription factors regulate the expression of the target genes by binding to the W-box， a cis-element with (T)(T)TGAC(C/T) sequence in the genes promoter regions. Therefore， the WRKY transcription factors are involved in various physiological and biochemical responses in the plant.

Key words: WRKY transcription factor;W-box;express;defense response

在長期的進化過程中，植物形成了一系列應對不良環境的有效機制。在生長和發育過程中，植物對脅迫的響應就是一種積極主動的應激過程。植物接受脅迫信號后，通過一系列的信號傳遞途徑，最終誘導相關基因的表達來抵御各種脅迫。在調節基因表達的過程中，轉錄因子起著重要的作用。

轉錄因子也稱為反式作用因子，是指那些能夠與基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性相互作用的DNA結合蛋白[1]。轉錄因子具有特異位點的識別與結合活性，或含同已知DNA結構域有相同特征的蛋白質，因而能保證目的基因以特定的強度、在特定的時間與空間表達。它通過與靶位點上順式作用元件結合，調節靶基因的轉錄起始和速度。轉錄因子通常由幾個獨立的功能域組成，包括DNA結合域、轉錄調控區(激活或抑制)、核定位信號區和寡聚化位點等。根據DNA結合域的結構，轉錄因子可以分為bHLH(堿性螺旋-環-螺旋)、bZIP(堿性亮氨酸拉鏈)、ERF、WRKY、MYB、Homeodomain、MADS-box、Zinc finger(鋅指蛋白)、HSF、HMG和AT hook等多個不同家族[2]。

WRKY因在其N-端含有由WRKYGQK組成的高度保守的7個氨基酸序列而得名。WRKY蛋白廣泛的參與植物對生物、非生物脅迫的應答反應、植物衰老和器官發育等一系列生理活動[3]，在植物的抗逆境反應中起著非常重要的作用。

1WRKY轉錄因子的發現

自1987年Paz-Ares首次克隆玉米轉錄因子以來，研究者們相繼從高等植物中分離出與干旱、高鹽、低溫、激素、病原響應及生長發育等基因表達調控相關的轉錄因子多達數百種。Ishiguro和Nakamura首次從甘薯(Ipomoea batatas)中克隆出一個能與 (T)(T)TGAC(C/T)序列(后被稱為W盒)結合的特異性蛋白的cDNA(SPF1)，隨后在不同植物中克隆出大量編碼W盒結合蛋白的cDNA，如野生燕麥(Avena fatua)的ABF1，2[4]，皺葉歐芹(Petroselinum crispum)的PcWRKY1，2，3[5]，擬南芥的ZAP1[6]等。WRKY蛋白通常被認為是一種植物所特有的轉錄因子家族，但是有人在原生生物賈第蟲[7](Giardia lamblia)和粘液菌[8](Dictyostelium discoideum)中也發現了WRKY類蛋白。截至2009年11月，NCBI(National Center for Biotechnology Information)中登記的WRKY基因已達627條。

2WRKY的結構特點及其演化

對WRKY蛋白進行序列分析，發現他們最主要的結構特點是各成員的DNA結合域中都至少含有一個WRKY結構域。WRKY結構域是一段大約由60個高度保守的氨基酸所組成的多肽序列，其中WRKYGQK序列是所有成員中都含有的7個絕對保守的氨基酸殘基。盡管WRKY轉錄因子具有高度保守的DNA結合域，但其整體的蛋白結構卻表現高度的差異性，如從擬南芥中確認的WRKYs中就有1個成員其蛋白(RRSI-R)除具有上述共性外，還含有病原體抗性基因(R基因)所具有的結構:TIR、NBS和LRR[9]。這就使WRKY蛋白分化出不同的家族，在特定的時間和空間行使不同的功能。WRKY轉錄因子另一個主要的結構特點是，其WRKY 結構域所對應的編碼序列中都含有一個位置高度保守的內含子，但其存在的意義還不清楚，可能預示著這類轉錄因子存在轉錄后加工的調節。

WRKY轉錄因子的DNA結合域中一般都含有一個鋅指結構。根據WRKY結構域的數量及鋅指結構的特征可將WRKY轉錄因子分為3類(圖1):含有兩個WRKY結構域的WRKY轉錄因子為第Ⅰ類，其鋅指結構類型是C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)型，如最早被發現的IbSPF1、PcWRKY1、AtZAP1和CsSE71等，這類轉錄因子的DNA結合功能主要由C-末端的WRKY結構域介導，而N-末端WRKY結構域的功能尚不清楚，它有可能參與WRKY轉錄因子與DNA相互結合的過程，從而提高轉錄因子結合靶位點的親和力和特異性;含有一個WRKY結構域的WRKY轉錄因子為第Ⅱ類，其鋅指結構類型也為C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H)型，如PcWRKY3、AfABF2和NtWIZZ等。大多數WRKY轉錄因子都含有1個WRKY結構域，因此，WRKY轉錄因子主要都屬于第Ⅱ類。第Ⅱ類WRKY轉錄因子的WRKY結構域與第Ⅰ類WRKY轉錄因子C-末端WRKY結構域序列的相似性比N-末端WRKY結構域序列的相似性更高，這也說明第Ⅰ類WRKY轉錄因子C-末端WRKY結構域與其它類型中只含有1個WRKY結構域的功能相同，即與靶DNA相互結合;而還有一些WRKY轉錄因子的鋅指結構與第Ⅰ、Ⅱ類不同，其鋅指結構為C2-HC(C-X7-C-X23-H-X1-C)型，因此將之歸為第Ⅲ類，如PcWRKY5、NtWRKY3、NtWRKY4和NtWRKY5等。第Ⅲ類WRKY轉錄因子只存在于高等植物中，而在一些低等植物如苔蘚植物中不存在。同時，高等植物中幾乎所有的第Ⅲ類WRKY轉錄因子都與植物的生物脅迫應答反應有關，這說明第Ⅲ類WRKY轉錄因子可能由于植物受環境壓力通過適應性進化所產生。不同的是，第Ⅰ類WRKY轉錄因子不僅存在于高等植物中，也存在與蕨類植物中，而且在一些不能進行光合作用的真核細胞中如粘液菌和單細胞原生生物中也被檢測到，這說明WRKY轉錄因子可能起源于15億～20億年前未分化出植物界之前的真核細胞，且第Ⅰ類WRKY轉錄因子是最初的轉錄因子表現形式。因此，WRKY基因的進化路線應為:第Ⅰ類作為最原始的WRKY類型，通過WRKY結構域的丟失或分裂過渡到第Ⅱ類，第Ⅱ類可能是通過鋅指結構中的H(組氨酸)轉變成C殘基產生了第Ⅲ類，而第Ⅲ類基因是在單子葉植物與雙子葉植物分化之后才形成的。在各類WRKY基因家族中，第Ⅲ類進化最活躍，第Ⅱ類較保守，第Ⅰ類最為保守。目前，已經將基因組WRKY基因進行系統分類的物種只發現擬南芥和水稻[10]，筆者已經將葡萄基因組中WRKY基因進行分類，列于表1。

Yamasaki等采用NMR方法研究了擬南芥WRKY4的C端WRKY結構域的空間結構(圖2)，這是第一個被闡明的WRKY蛋白的三維結構。結果表明:該結構域是由4個β鏈組成反向平行的β折疊，而位于N端的β折疊包含保守的WRKYGQK序列，該片段參與DNA結合，其中R-K-G起重要作用。在β折疊的末端有保守的Cys/His殘基與之形成Zn2+結合口袋。因此，WRKY轉錄因子的結合域含有直接與DNA和Zn2+結合的空間結構特征[11]。N端相鄰的β鏈之間的連接借助于Gly形成氫鍵從而形成β折疊[12]。見圖2。

多種體內和體外試驗表明，WRKY轉錄因子的WRKY結構域能特異性的與W盒相互作用，其中該序列(T)(T)TGAC(C/T)中的TGAC核心序列是固定不變的。通過凝膠電泳遷移率分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)也證明了這一點。W盒保守序列中的TGAC任一核苷酸被替換，WRKY轉錄因子與之結合的能力都將大幅下降或完全消失[13]，而加入磷酸酶抑制劑后，這種結合作用又會有所恢復。此外，WRKY轉錄因子與W盒的結合還需要Zn2+等金屬離子的參與和磷酸化作用等。盡管WRKY蛋白總是傾向于結合W盒序列，但不同的WRKY蛋白對于其結合的W盒元件的類型及其組成具有一定差異和偏好性。依照W盒的數量、排列方式、間距以及側翼序列的不同，各種WRKY蛋白專性選擇不同的W盒與之結合，行使特有的功能活性。WRKY存在于許多與植物防衛反應相關基因的啟動子中，如煙草中的CHN50基因和擬南芥中的NPR1基因。某些WRKY轉錄因子自身啟動子中也存在W盒，因此，某些WRKY轉錄因子的表達也可能通過另外的WRKY或其它可能與W盒結合的調控因子來調節，從而形成復雜的植物防衛反應、生長發育等各種生理活動的調節網絡。

WRKY轉錄因子一般是在細胞質中合成后經跨膜轉運到細胞核，在轉錄水平上對基因進行調控，因此在WRKY轉錄因子的WRKY結構域外都存在核定位信號。

3WRKY轉錄因子的表達特點

WRKY基因在植物體內并非組成型表達。目前已鑒定和克隆的WRKY基因都是受各種因子的激發而誘導表達的。這些因子主要有衰老、發育、休眠、代謝、激素調節和干旱、紫外線輻射、創傷、寒冷等生物學過程和環境因子。另外，病原菌也是許多WRKY基因表達的誘導因素。如，Rushton等[5]在皺葉歐芹中發現了與抗病相關基因PR1啟動子的W盒特異性結合的3個WRKY基因。后來又有研究表明，WRKY基因對各種病原體有防御反應，可能是因為該基因在侵染的過程中參與調控，也可能是因為WRKY基因在病原體接近抗病基因(如擬南芥中的NPR1基因)的時候發揮了至關重要的作用[14]。WRKY基因的表達具有組織特異性，已發現在植物的不同器官如根、莖、葉、花、果實、維管組織中都有相關WRKY基因的表達[15]。另外，WRKY基因的表達具有快速、瞬時的特點。例如皺葉歐芹受真菌的誘導，15 min后與未受誘導的空白對照組相比，細胞中的WRKY4轉錄本已有積累，45~90 min之間達到最大值，而后迅速下降[16]。而煙草葉片機械創傷(切口)10 min后，與不作機械創傷的相比，受傷的及上層未受傷的葉片中都有WRKY轉錄本(WIZZ)積累，30 min后達到最大值，然后開始下降[17]。

有些WRKY蛋白還具有自我調控的能力。Robatzek和Somassich[18]在擬南芥中發現，WRKY6蛋白對其自身表達有明顯的抑制作用，對其同一亞類的WRKY42基因的表達也具有抑制作用。序列分析表明，兩者的啟動子中都含有W盒。Eulgem等[19]在皺葉歐芹中發現，PcWRKY1啟動子中也含有W盒，WRKY1本身或其它WRKY蛋白能激活其表達。前一種自身抑制功能可能是WRKY蛋白的組織特異積累所需;而后一種自身激活功能預示著WRKY基因存在著某種組成型低水平的表達，其產物是以無活性狀態存在于細胞質中，當外界誘導后被激活，如磷酸化，然后激活WRKY基因的表達。

4WRKY轉錄因子參與植物防衛反應

植物防衛反應由兩個相互關聯的反應組成:(1)PTI(pathogen-associated molecular pattern (PAMP) -triggered immunity)，它是通過病原體的分子信號識別后引發，進而激活下游MAPK激酶級聯反應和防御基因的表達來實現的;(2)ETI(effctor-triggered immunity)，它是通過能夠直接或間接的識別病原的植物疾病防衛蛋白(PR蛋白)實現的。PTI和ETI激活系統的防御反應(系統獲得性防御，SAR)可以被植物激素調節，主要有茉莉酸和水楊酸。茉莉酸誘導的植物防衛反應一般被死體營養性病原和害蟲激活，而水楊酸誘導的防衛反應通常是被活體營養性病原激活。茉莉酸和水楊酸所發信號經常起拮抗作用，但是Mur等也發現了兩者的協同作用[20]。這些防衛反應的實現需要大規模的轉錄調控，包括WRKY等轉錄因子家族。

4.1擬南芥中的WRKY轉錄因子

人們主要采用功能缺失或功能獲得的方法，來研究WRKY在防衛反應起正調控還是負調控的作用。AtWRKY52具有亮氨酸拉鏈結構和一個WRKY結構域，它對細菌性枯菌病(Ralstonia solanacearum)有很強的防衛作用[21]。Deslandes等發現AtWRKY52對植物細胞核內的與AtWRKY52同源的細菌效應因子PopP2有作用，這一發現更清楚的顯示出細胞核在植物防衛中起著很重要的作用。AtWRKY70轉錄因子的調控作用需要茉莉酸和水楊酸的誘導，并且依賴抗病基因的間接作用。但是，最近有人質疑AtWRKY70轉錄因子對茉莉酸和水楊酸的依賴性[22]。

Dong等[23]研究擬南芥WRKY基因家族在植物防衛反應中的表達譜，Northern雜交顯示，植物感染了細菌病原體后，72個AtWRKY 基因中的 49個有表達差異。這些病原體誘導的WRKY基因可根據其在野生型和防衛信號途徑突變缺陷型的表達模式進一步分組。檢測翻譯起始位點5'端的上游序列，發現在受病原體調節的AtWRKY 基因啟動子中有大量的W盒。表明WRKY轉錄因子超家族的成員中，某些成員廣泛參與了另一些成員的轉錄激活或抑制。

此外，研究表明[18，24，25]WRKY轉錄因子還參與了植物諸如形態發育、葉片衰老等一系列的生命活動。對一些AtWRKY基因表達的研究發現，AtWRKY4、6、7、11、53基因在葉片衰老早期其表達量會顯著增高，說明WRKY基因可能在葉片衰亡的過程中起調控作用。同時，Johnson等[26]在擬南芥突變株中發現一種被Tag1內源轉座子標記的TTG2基因，它能夠表達出WRKY轉錄因子，并首次揭示這種WRKY基因的表達與植物形態發育有關，會影響植物毛狀體和種皮的發育和建成。

4.2水稻中的WRKY轉錄因子

水稻的基因組中有100條WRKY基因，這些WRKY轉錄因子在水稻的防衛反應中起著相當重要的作用。WRKY基因經常出現在染色體的重復區域，這表明基因組的重復是植物中擴大WRKY基因家族的機制之一。一些WRKY轉錄因子成員與對病原體的防衛反應有關，而且，這些WRKY轉錄因子的過表達可以增強植物對病原體的防衛反應。如，OsWRKY13基因的過表達可以增加植株對細菌疫病Xanthomonas oryzae pv oryzae和真菌Magnaportha grisea的抗性[27，28]。OsWRKY31的異位表達增加了對真菌的抗性，改變了外側根的形成，同時也改變了兩個生長素早期應答基因的組成型表達，其對照及RNAi植株卻檢測不到[29]。這兩種改變與抗病性的增加是否有功能上的聯系還不得而知。OsWRKY89的過表達可以使葉表蠟質層增厚，從而增加抵御真菌和白背飛虱的能力;而OsWRKY89的基因敲除植株中蠟質層變薄，對M. grisea也變的敏感[30]。

4.3其它植物中的WRKY轉錄因子

其它一些完成了基因組測序的植物中也已經鑒定了大量的WRKY基因，其中木瓜(Carica papaya)中66條，楊樹(Populus)中104條，高粱(Sorghum bicolor)中68條，苔蘚(Physcomitrella patens)中38條。目前，還沒有發現有顯示這些轉錄因子在植物防衛反應中作用的研究報道。在葡萄中有一些相關報道，如葡萄VvWRKY1基因在轉基因煙草中的過表達會使轉基因植株對各種真菌很敏感[31]。然而，葡萄VvWRKY2基因的異位表達卻增強了植株對死體營養型真菌Alternaria tenuis、B. cinerea和 Pythium的抗性[32]。有研究發現[33]，紅辣椒中CaWRKY1轉錄因子是防衛反應的負調控因子，因為它的過表達造成了實驗中對假單胞菌和煙草花葉病毒敏感的細胞的死亡。Skibbe等[34]研究表明，本生煙草中的兩個基因NaWRKY3和NaWRKY6可以調節由害蟲引起的茉莉酸誘導的間接反應。NaWRKY3、NaWRKY6基因沉默后的煙草植株喪失對害蟲攻擊的抵抗力。

5展望

WRKY轉錄因子是接受逆境脅迫信號、調控逆境相關基因表達的重要轉錄因子之一，在植物逆境適應和抵抗中具有重要作用。目前對于WRKY轉錄因子的研究主要集中在逆境誘導下WRKY轉錄因子的表達模式進而提高植物抗逆性能力方面。但是，對于 WRKY 轉錄因子參與的逆境下基因調控體系還不完全清楚。它們在各個水平上，是直接調節下游靶基因的表達，還是通過激活或抑制其它的轉錄因子，或者通過正反饋的方式調控WRKY基因從而調節防御基因的表達，都有待深入的研究。對于這些問題的深入理解，是闡明 WRKY 轉錄因子的功能及其在逆境調控中扮演的角色的關鍵。隨著轉錄組學、免疫沉降等各種新技術的廣泛應用，人類將更加深入的理解WRKY基因在植物抗逆中的作用，在此基礎上，進一步將WRKY基因應用于植物抗逆工程中，使植物抗逆性育種的目標得以盡快實現。

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