不同碳氮源對復合木質(zhì)素降解菌木質(zhì)素降解酶系活力的影響

摘要:通過小麥秸稈固態(tài)發(fā)酵試驗，研究了不同的碳、氮源對2株側(cè)耳屬白腐真菌Tf1(Pleurotus sajor-caju)和JG1(Pleurotus Cornucopiae Roll)混合發(fā)酵產(chǎn)酶活力的影響。結(jié)果表明，Lip和MnP是復合木質(zhì)素降解菌Tf1+JG1主要的木質(zhì)素降解酶。以淀粉為碳源，麩皮為氮源時總酶活最高，分別為1 419.01 U/g和1 626.64 U/g。

關(guān)鍵詞:碳源;氮源;木質(zhì)素降解菌;木質(zhì)素過氧化物酶;錳過氧化物酶;漆酶

中圖分類號:S636.2文獻標識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.02.006

Effect of Different Carbon and Nitrogen Sources on Lignin Degradation Enzyme Activity of Combined Lignin-Degrading Fungus

FAN Huan1， LIANG Jun-feng2， ZHAO Run2， ZHANG Jin-feng2， ZHANG Hong-sheng2

(1.Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， Tianjin 300112， China; 2.Institute of Agro-environmental Protection， Ministry of Agriculture， Tianjin 300191， China)

Abstract:The present study was conducted to investigate the effect of different carbon and nitrogen sources on ligninolytic enzyme activity of the combination of Tf1(Pleurotus sajor-caju)and JG1(Pleurotus Cornucopiae Roll)of the wheat straw after the substrate solid state fermentation. Results showed that Lip and MnP were the major lignin-degrading enzymes of Tf1+JG1. Starch and wheat bran were the optimum carbon and nitrogen sources. After 9 d fermentation. the total enzyme activities were respectively 1 419.01 U/g and 1 626.64 U/g.

Key words: carbon sources; nitrogen sources; lignin-degrading fungus; lignin peroxidases; Mn-dependent peroxidases; Laccase

秸稈成分中的纖維素和半纖維素約70%能夠被反芻動物的瘤胃微生物降解利用，但由于木質(zhì)素和半纖維素相互交聯(lián)，并將纖維素鑲嵌于內(nèi)，形成堅固的酯鍵或醚鍵;同時，木質(zhì)素又包圍纖維素形成一種外圍基質(zhì)，阻礙微生物和酶對纖維素和半纖維素的降解。草食動物體內(nèi)缺乏降解木質(zhì)素的酶，所以秸稈細胞壁的這種木質(zhì)素—纖維素—半纖維素的特殊復合體限制了動物對纖維素、半纖維素等成分的降解和利用，使得秸稈細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不能被釋放出來，從而導致秸稈的消化率降低。因此，提高秸稈消化率的關(guān)鍵是降解木質(zhì)素[1]。白腐真菌以其獨特的生理生化機制和強大的降解代謝能力而成為木質(zhì)素降解研究的模式菌株，是已知的唯一能在純系培養(yǎng)中有效地將木質(zhì)素降解為CO2和H2O的一類微生物[2]。

白腐真菌所具有的降解木質(zhì)素能力源于其所產(chǎn)生的一個復雜的胞外過氧化物酶系統(tǒng)，這一系統(tǒng)主要由3種酶構(gòu)成:木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac)，另外還有其它幾種酶的綜合作用[3]。大量研究表明，白腐真菌表現(xiàn)出較強的種間差異，同時培養(yǎng)發(fā)酵條件的不同處理秸稈的效果也不同，并且碳源和氮源是其產(chǎn)酶的一個極為重要的影響因素，可通過改變培養(yǎng)條件大大提高菌株木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)量[4，5]。

在本實驗室前期研究中，篩選出多株側(cè)耳屬白腐真菌菌株，其中，復合菌株Tf1+JG1固態(tài)發(fā)酵21 d對小麥秸稈木質(zhì)素的降解率為38.41%[6]。本研究就常見的幾種碳源和氮源對其木質(zhì)素降解酶系中的木質(zhì)素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)合成影響進行了試驗，以期為研究其木質(zhì)素降解酶合成的營養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1供試菌株

木質(zhì)素選擇性降解菌株Tf1(Pleurotus sajor-caju)，JG1(Pleurotus Cornucopiae Roll)，購自天津食用菌研究中心，本實驗室進行了定向篩選并保藏。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1CPDA培養(yǎng)基馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 100 mg，瓊脂18 g，自來水1 000 mL， 121℃下濕熱滅菌30 min。

1.2.2固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基取粉碎后過0.45 mm篩的小麥秸稈15.00 g裝入三角燒瓶中，碳源5%，氮源1%，以1∶3的料液比加入營養(yǎng)液[7]，拌勻，于121℃濕熱滅菌30 min。

1.3菌塞的制作

將斜面菌株接入滅菌后的CPDA 平板上，放入培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲布滿整個平皿后用直徑為10 mm無菌打孔器打出均一菌塞。在滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入Tf1和JG1菌塞各10塊。

1.4粗酶液的提取方法

將培養(yǎng)9 d的樣品用無菌竹簽攪拌均勻后，稱取5.00 g樣品加入30.00 mL，pH為4.5，0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，4 ℃，200 min浸提4 h后經(jīng)4層紗布過濾，4 ℃，3 500 min離心10 min，取上清液即為粗酶液。

1.5酶活的檢測方法[8]

1.5.1漆酶(Lac)活力測定室溫下0.5 mmol/L的ABTS溶液2 mL，加入2 mL酶液啟動反應(yīng)，測定波長在420 nm處最初3 min內(nèi)吸光值的增加。每克樣品每分鐘增加0.001個吸光度所需酶量定義為1個活力單位(U)。

1.5.2木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活力測定反應(yīng)體系中含0.125 mol/L，酒石酸鈉緩沖溶液3.2 mL，10 mmol/L藜蘆醇0.1 mL和0.6 mL酶液，加入10 mmol/L H2O2 0.1 mL啟動反應(yīng)，室溫下進行反應(yīng)。測定波長310 nm處在最初3 min內(nèi)的吸光值。每克樣品每分鐘增加0.001個吸光度所需酶量定義為1個活力單位(U)。

1.5.3錳過氧化物酶(MnP)活力測定室溫下反應(yīng)體系中含50 mmol/L，pH4.5乳酸鈉緩沖溶液3.4 mL，1.6 mmol/L的MnSO4 水溶液0.1 mL和酶液0.4 mL，加入0.1 mL，1.6 mmol/L的H2O2啟動反應(yīng)，測定反應(yīng)最初3 min內(nèi)，波長240 nm處的吸光值。每克樣品每分鐘增加0.001個吸光度增加所需酶量定義為1個活力單位(U)。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用SAS軟件進行單因素方差分析。

2結(jié)果與分析

2.1碳源對木質(zhì)素降解酶系活力的影響

研究表明，微生物對木質(zhì)素的降解是依靠其分泌的木質(zhì)素降解酶，而不同的菌種可能具有不同的降解酶系統(tǒng)。一個菌株的木質(zhì)素降解能力，是由它的生理特性和總體代謝能力共同決定的[9]。

本試驗測定了6種不同的碳源對復合木質(zhì)素降解菌Tf1+JG1在小麥秸稈固體發(fā)酵Lip、MnP及Lac酶活力的影響，結(jié)果見圖1。Lip的酶活以淀粉為最高，葡萄糖次之，蔗糖為最低，分別為691.08 ，629.11和384.23 U/g(P<0.05);MnP的酶活以玉米粉為最高，淀粉次之，蔗糖為最低，分別為761.44 ，697.80和297.22 U/g(P<0.05)。Lac的酶活以蔗糖為最高，麥芽糖次之，葡萄糖為最低，分別為143.26 ，39.40和11.83 U/g(P<0.05)，但漆酶整體活力不高;總酶活以淀粉最高，但與葡萄糖和玉米粉的總酶活差異不顯著。由此可見，同一種木質(zhì)素降解酶在不同的碳源作用下，其活力是不同的，而且同一菌株不同酶表達所需的營養(yǎng)條件也各不相同的。研究結(jié)果分析表明，Lip和MnP是Tf1+JG1產(chǎn)生的主要木質(zhì)素降解酶種。真菌Lip和MnP屬于誘導酶，碳源對于菌體酶合成的影響顯著，有研究表明，提高底物碳源的聚合度有利于增強對白腐真菌的誘導作用[10]。

2.2氮源對木質(zhì)素降解酶系活力的影響

在以5%葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別以1%酒石酸銨、豆粕、硫酸銨、蛋白胨、麩皮做為氮源，考察Tf1+JG1產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在采用不同的氮源時，復合木質(zhì)素降解菌產(chǎn)木質(zhì)素降解酶系的活性高低有很大差異，影響MnP活力從高到低的氮源依次為酒石酸銨、豆粕、麩皮、蛋白胨和硫酸銨;影響Lip活力高低依次為麩皮、酒石酸銨、豆粕、蛋白胨和硫酸銨。由圖2可以看出，以硫酸銨作為氮源培養(yǎng)Tf1+JG1所得的木質(zhì)素降解酶系活力普遍較低，這與某些白腐真菌的產(chǎn)酶特征相符[11]。其中硫酸銨的效果最差，Lip和MnP酶活力僅分別為401.32 U/g和309.91 U/g。采用有機氮源所得的酶活性均較高，以麩皮為氮源，Lip酶活力最高可達1 026.44 U/g(p<0.05);麩皮和豆粕為氮源的MnP活力分別為572.99 U/g和616.94 U/g，均達到酒石酸銨的92%以上。6種不同氮源中總酶活以麩皮為最高，酒石酸銨次之，硫酸銨為最低，分別為1 626.64 ，1 263.16 和770.98 U/g(p<0.05)。

3結(jié)論

白腐真菌產(chǎn)酶活力的高低決定了降解能力的大小，本試驗以檢測Lip，MnP及Lac的酶活性大小為參考，比較不同碳氮源對復合木質(zhì)素降解菌Tf1+JG1產(chǎn)木質(zhì)素降解酶能力的影響。結(jié)果表明不同碳、氮源對產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)的效果各異，同一碳、氮源對LiP、MnP和Lac的作用效果也不同。我們還將結(jié)合不同碳氮源對降解木質(zhì)素能力的影響(另文發(fā)表)，以確定Tf1+JG1麥秸發(fā)酵的最佳碳氮源組合。

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