馬鈴薯莖段再生及成苗技術(shù)

摘要:回顧了植物組織再生技術(shù)相關(guān)的培養(yǎng)條件和外植體的研究結(jié)果，通過本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果提出了馬鈴薯莖段培養(yǎng)的技術(shù)要點(diǎn)及相關(guān)參數(shù)，其中包括外植體處理、培養(yǎng)基、外源激素、光照及溫度條件、試管苗移栽的各個步驟。研究結(jié)果不僅可應(yīng)用于植物生物技術(shù)研究，同時可應(yīng)用于馬鈴薯試管苗擴(kuò)大生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞:馬鈴薯;組織培養(yǎng);莖再生;體外條件

中圖分類號:S532文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A DOI編碼:10.3969/j.issn.1006-6500.2010.02.012

Stem Cutting Culture of Potato in vitro

WU Qing， YAO Xin-ling

(College of Life Science，Ningxia University，Yinchuan 750021，China)

Abstract:Studies involving in culture condition and explants of plant tissue culture were reviewed in this paper. In terms of experiments in our lab， parameter and key points in culturing in vitro of potato stem cuttings were put forward， including treatments of explants， culture medium， external hormones， and conditions of light and temperature as well as tube plantlets transplanting. The parameter and points can be used not only in biotechnology study of plant， but also in amplification production of tuber plantlets.

Key words: potato;tissue culture;stem regeneration;condition in vitro

1體外條件下植物組織再生

植物組織培養(yǎng)(Plant tissue culture)是從20世紀(jì)30年代初期發(fā)展起來的一項(xiàng)生物技術(shù)，它是指在無菌條件下，將離體的植物器官(如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實(shí)、種子等) 、組織(如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等) 、細(xì)胞(如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等) 、胚胎(如成熟和未成熟的胚) 、原生質(zhì)體，在人工控制的條件下，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽等，或長成完整的植株的技術(shù)[1，2]。

組織培養(yǎng)是建立在植物細(xì)胞全能性學(xué)說的理論基礎(chǔ)上，經(jīng)過長期反復(fù)科研實(shí)踐，逐步發(fā)展形成一套較為完整的技術(shù)體系。現(xiàn)在幾乎所有的植物細(xì)胞與組織材料均可以培養(yǎng)成功。植物細(xì)胞全能性是指植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。植物細(xì)胞全能性的原理是指植物體的每一個細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因，從理論上講，植物體的每一個活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性[3]。Schwann在1839年明確指出:“如果具有與有機(jī)體內(nèi)一樣的條件時，每個細(xì)胞應(yīng)該可以獨(dú)立生活和發(fā)展”。德國著名植物學(xué)家哈伯蘭特(G. Haberlandt)在細(xì)胞學(xué)說的基礎(chǔ)上于1902年提出了植物細(xì)胞全能性學(xué)說。他認(rèn)為，高等植物的組織、器官可以不斷分割，直到單個細(xì)胞。如果每個細(xì)胞都有植物個體一樣的性質(zhì)和能力，那么，可以通過植物細(xì)胞培養(yǎng)使單個細(xì)胞發(fā)育成為一個新個體。1943年，美國White在煙草愈傷組織中偶爾發(fā)現(xiàn)形成一個芽，證實(shí)了G. Haberlandt的論點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，高度分化的植物細(xì)胞仍然具有發(fā)展成完整植株的潛在能力，這就是植物細(xì)胞的全能性。植物細(xì)胞的全能性(totipotency)是指植物體中單個已經(jīng)分化的細(xì)胞具有發(fā)育成完整個體的全部遺傳物質(zhì)，在適宜的條件下，能夠發(fā)育成完整的新植株。

近年來，這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用的范圍十分廣泛，尤其在馬鈴薯組織培養(yǎng)(莖尖脫毒和快速擴(kuò)繁)方面更具其他技術(shù)手段無法比擬的優(yōu)勢。

2馬鈴薯莖段培養(yǎng)技術(shù)

馬鈴薯(Solanum tuberoosum L.)屬茄科茄屬植物，是一種天然食品，它集藥用、保健、食用為一體，具有豐富的物種資源，發(fā)展前景廣闊。生產(chǎn)中多采用塊莖進(jìn)行無性繁殖，在其繁殖過程中，易受病毒和細(xì)菌侵染導(dǎo)致產(chǎn)量下降，經(jīng)數(shù)代積累可使種性退化。利用無菌操作通過組織和細(xì)胞培養(yǎng)，不但可產(chǎn)生去病毒的試管苗，還可以縮短生長周期，并建立一系列的組培快繁體系，而進(jìn)行大批量的快速繁殖。

植物組織培養(yǎng)的過程包括:離體的植物器官、組織、細(xì)胞經(jīng)脫分化形成愈傷組織，愈傷組織再分化形成根、芽，最后形成完整的植物體。下面具體闡述馬鈴薯組織培養(yǎng)的步驟。

2.1培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基配制的合理與否，是組織培養(yǎng)成敗關(guān)鍵之所在。化學(xué)合成培養(yǎng)基大致由6種成分組成，即糖類、多種無機(jī)鹽類、微量元素、氨基酸、酰胺、嘌呤、維生素和生長素。

為減少工作量，先將各種藥品配成比所需濃度高20～500倍的母液，貯放在冰箱內(nèi)，用時再按比例稀釋，通常配成大量元素、微量元素、有機(jī)成分、鹽、激素等母液，見表1、表2。

試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基MS + 6-BA(細(xì)胞分裂素)0.1 mg/L + NAA(萘乙酸)10 mg/L適于初代培養(yǎng)，有助于根和芽的分化;培養(yǎng)基MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 15 mg/L 適于增殖培養(yǎng)，利于愈傷組織的產(chǎn)生并促進(jìn)芽的分化;培養(yǎng)基1/2MS + NAA 10 mg/L + 多效唑 100 mg/L 適于生根培養(yǎng)，當(dāng)試管苗根長到1 cm時移栽易成活。

2.2莖段培養(yǎng)的環(huán)境條件

雖然馬鈴薯組織培養(yǎng)操作并不困難，但對于一些技術(shù)環(huán)節(jié)的要求卻十分嚴(yán)格，稍有疏忽，就會使試驗(yàn)無法進(jìn)行下去，甚至導(dǎo)致整個試驗(yàn)的失敗，給科研和生產(chǎn)造成損失。其中污染問題是馬鈴薯高效組織培養(yǎng)中需要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題，它直接影響組培苗的產(chǎn)量[4-6]。因此，分析和控制馬鈴薯組織培養(yǎng)過程中的環(huán)境條件，意義非常重要[7]。

馬鈴薯組織培養(yǎng)一般都是在無菌條件下進(jìn)行的，因此，創(chuàng)造操作室的嚴(yán)格無菌條件及保證無菌操作十分必要。首先是無菌室滅菌，應(yīng)在接苗前7 d和3 d兩次對操作室噴灑2%的新潔爾滅，同時根據(jù)無菌室面積的大小，用不同量的高錳酸鉀及甲醛溶液熏蒸室內(nèi)，一般每平方米的室內(nèi)需要2 g高錳酸鉀加2 mL甲醛，再打開紫外線燈連續(xù)照射7 d;其次是操作工具采用高壓滅菌或高溫高壓滅菌，滅菌后的工具應(yīng)立即放入無菌室以備用，并避免傳遞感染;第三是工作人員服裝也要熏蒸或高溫高壓滅菌，工作人員在進(jìn)入無菌室前要洗手，去掉指甲中的污物，入室時要穿上經(jīng)過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。在操作前應(yīng)戴好滅菌的膠手套，并用70%酒精擦洗;第四是操作過程中嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作規(guī)程，即每個接苗環(huán)節(jié)都不能忽略，試管口或培養(yǎng)瓶口都要酒精燈過火，剪刀、鑷子、接種鉤都應(yīng)浸泡在90%的酒精中，用火焰燒過后，待稍冷卻即可操作使用，這樣既可防止傳遞感染雜菌，又可防止工具過熱灼傷幼苗而影響組織培養(yǎng)的成活。此外，對超凈工作臺除嚴(yán)格進(jìn)行滅菌外，也應(yīng)定期檢查氣扇箱及過濾網(wǎng)，應(yīng)及時進(jìn)行清洗除塵。必要時也可于氣扇箱內(nèi)用5 g高錳酸鉀和5 mL甲醛熏蒸，但在操作前1 h應(yīng)排除滅菌氣體，以免熏蒸工作人員的呼吸系統(tǒng)及眼睛。

馬鈴薯試管苗的溫度條件是決定組織培養(yǎng)快慢和幼苗素質(zhì)的關(guān)鍵因素。一般溫度稍高幼苗伸長較快，且節(jié)間過長，根系發(fā)育較弱;溫度稍低，則根系發(fā)生多，幼苗生長緩慢。根系和莖葉生長比較協(xié)調(diào)的溫度是20～30 ℃。一般接苗初期培養(yǎng)溫度應(yīng)控制在18 ℃左右，以后至轉(zhuǎn)接前則將溫度控制在23 ℃左右，培養(yǎng)出的試管苗則根系和莖葉發(fā)育適中，幼苗健壯。

若最后一次培養(yǎng)，即培養(yǎng)的試管苗為假植苗，要求根系發(fā)育良好，莖節(jié)間短，幼葉綠壯，可較好地提高成活率。初期溫度應(yīng)控制在16～18 ℃，當(dāng)根系發(fā)生時，溫度則提升至22～23 ℃，并保持到假植期，一般成活率可達(dá)90%以上，且幼苗健壯，定植后生長良好，顯著增加結(jié)薯率。

光照條件如何是決定組織培養(yǎng)幼苗素質(zhì)的另一重要因素。在培養(yǎng)苗轉(zhuǎn)接初期，在較弱的光照條件下培養(yǎng)，有利于幼苗分化良好的根系，一般光照強(qiáng)度應(yīng)低于1 000 lx。當(dāng)培養(yǎng)苗形成幼根后，將光照強(qiáng)度提升至2 000～3 000 lx以上，每日光照10～12 h。

總之，創(chuàng)造無菌條件和嚴(yán)格的無菌操作室是保證組織培養(yǎng)不受雜菌感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是決定組織培養(yǎng)成敗的必要措施;溫度的高低和光照強(qiáng)弱是影響組織培養(yǎng)幼苗素質(zhì)的重要因素。一般培養(yǎng)初期應(yīng)在稍低的溫度和較弱的光照條件下培養(yǎng)，后期應(yīng)滿足光熱條件，以提高幼苗轉(zhuǎn)接成活率及培育壯苗的效果。

2.3外植體及其培養(yǎng)

將從母株上取下的組織進(jìn)行一定的剝離和分割，經(jīng)過流水沖洗數(shù)分鐘，再浸入適宜濃度的化學(xué)藥劑如漂白粉溶液(1%～10%)、次氯酸鈉溶液(0.5%～10%)、升汞溶液(0.01%)、乙醇(70%)或過氧化氫(3%～10%)等溶液進(jìn)行處理，最后經(jīng)無菌水沖洗并適當(dāng)分割即成外植體。制備外植體的原則是無菌和有活性，無菌是外植體植被的要求，有雜菌帶入培養(yǎng)基會造成微生物污染，而阻滯甚至殺死外植體。有活性是外植體制備的前提，無活性的外植體的培養(yǎng)在植物組織培養(yǎng)中是無意義的。

馬鈴薯以收獲的種薯儲藏后冬季在溫室催芽，待其新梢長至5～6 cm時，剪其莖尖和帶腋芽的莖段(1～1.5 cm)作為外植體。取莖尖及帶腋芽莖段(1～1.5 cm) 剪去葉片，經(jīng)流水沖洗2～3 h后，在超凈工作臺上用75%酒精滅菌10 s，用無菌水沖洗3遍，再用0.1%升汞浸泡6 min，用無菌水沖洗4～5遍，即獲外植體。

初代培養(yǎng)即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。初代培養(yǎng)時，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。將所獲材料在無菌條件下接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0.1 mg/L + NAA 10 mg/L + GA3 5 mg/L)上。

愈傷組織(Callus)是在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)無序生長的薄壁細(xì)胞。經(jīng)歷脫分化和再分化兩個過程:脫分化是一個成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過程，即形成愈傷組織的狀態(tài)叫脫分化。再分化是愈傷組織內(nèi)的細(xì)胞具有異質(zhì)性，能重新分化的能力。愈傷組織在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上經(jīng)一定時間即能誘導(dǎo)生長成整株植物。因此愈傷組織既可是某種植物代謝產(chǎn)物的來源，又可是誘導(dǎo)成株的主要途徑之一。

在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，也難以種植到栽培介質(zhì)中去，這些培養(yǎng)的材料可統(tǒng)稱為中間繁殖體，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后達(dá)到邊繁邊生根的目的[8]。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎(chǔ)，設(shè)繁殖系數(shù)為5，那么經(jīng)10代將生成210株苗。

頂芽或腋芽接種10 d后，芽開始萌動，4周后長成2～3 cm高的芽苗，葉片綠色，生長正常，將獲得的無菌苗剪成1～1.5 cm長的莖段接種到繼代培養(yǎng)基(MS + 6-BA 0.5 mg/L + NAA 15 mg/L)上。2周后，莖段長至4～6 cm，腋芽萌動且出現(xiàn)分枝，葉片濃綠，生長健壯。

當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi)。因此，生根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程。最后要使生出的不定根濃密而粗壯。生根可采用1/2或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉或用低濃度的細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA等)。在生根壯苗培養(yǎng)基上，大多數(shù)植物要分離成單苗，有的可分成小叢苗。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)后應(yīng)停止增殖，迅速生根，同時苗也長高，便于以后移栽。

將增殖所獲得的幼苗剪至1～2 cm長，接種到生根培養(yǎng)基(1/2MS + NAA 10 mg/L + 多效唑100 mg/L)上，3 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)基部有白色的細(xì)根長出。生根率達(dá)100%。平均單株生根數(shù)為5條，以后逐漸長成完整植株。培育溫度為24～26 ℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度為1 500～2 500 lx。

將組培生成的健壯芽苗轉(zhuǎn)到微型薯誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+NAA0.5 mg/L+IBA)上，10 d左右，試管苗基部陸續(xù)長出白色細(xì)根，15 d后，莖段腋芽處開始露出氣生根，待長至1.5～2.0 cm時，在腋芽處長出表皮為深紫色的微型薯，4周后，微型薯長至0.5～1.0 cm 時，即可采收。

2.4試管苗移栽

試管苗移栽是組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，為了做好試管苗的移栽，應(yīng)該選擇合適的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個工作有條不紊地進(jìn)行。由于試管苗是在優(yōu)越的培養(yǎng)環(huán)境下在培養(yǎng)基上生長的產(chǎn)物，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件下生長的正常小苗有著很大的差異。必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。

移植是一個由異養(yǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)的過程，移植可根據(jù)生根情況來進(jìn)行。若發(fā)現(xiàn)基部生有較濃密的不定根，長度在1 cm以內(nèi)，就可移栽入土。此時把試管苗打開瓶口放置室內(nèi)煉苗5～10 d，培養(yǎng)瓶生長的試管苗，達(dá)到株高3～5 cm具7～8片葉，葉片綠色，根系生長良好時，從瓶中小心取出，移至室外，進(jìn)行幾天的煉苗過程。從試管中取出小植株，輕輕洗掉根部培養(yǎng)基，栽入塑料營養(yǎng)缽或育苗盤中，營養(yǎng)缽盛有經(jīng)燒烤或常壓滅菌的培養(yǎng)土(腐殖土∶沙=1∶1)。栽后給予較高的空氣濕度條件。首先，營養(yǎng)缽的培養(yǎng)土要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭小拱棚，以減少水分的蒸騰，并且初期要常噴霧，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)小苗有生長趨勢，可逐漸減少濕度，將拱棚兩端打開通風(fēng)，并且減少噴水次數(shù)，使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，少澆水或不澆水，促進(jìn)小苗長得粗壯。經(jīng)過上面幾個階段，小苗已生根成為完整的再生植株，可以被移植到土壤里了。

3組織培養(yǎng)的前景及問題

植物組織培養(yǎng)技術(shù)已為人們廣泛的應(yīng)用在各個領(lǐng)域，它為許多學(xué)科研究植物生長發(fā)育、抗性生理、激素及器官發(fā)生與胚胎發(fā)生等提供了許多良好試材和有效途徑。由于組織培養(yǎng)是在人工控制的條件下進(jìn)行的，容易掌握花芽分化和開花的成因，在試管內(nèi)人工受精，獲得雜種或自交種;通過分離單倍體細(xì)胞，能培育純合的二倍體優(yōu)良品系，縮短育種時間;通過選擇突變體，提高植物的品質(zhì)，增強(qiáng)抗鹽、抗旱、抗寒等方面的能力，擴(kuò)大植物的生長范圍;將體細(xì)胞冷藏在低溫下，建立基因庫，達(dá)到保存物種的目的;獲得藥用價值高和工業(yè)生產(chǎn)所需的次生產(chǎn)品，解決部分獲得難度大的問題，這些應(yīng)用已引起廣大的關(guān)注。

馬鈴薯脫毒苗在快繁過程中出現(xiàn)的異常現(xiàn)象，遺傳因素影響甚少。適當(dāng)?shù)恼{(diào)整試管苗的生存環(huán)境條件，即選擇健康的外植體，添加適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)物質(zhì)，溫度控制在24 ℃左右，濕度保持在75%上下，培養(yǎng)基的軟硬隨時調(diào)節(jié)，縮短繼代培養(yǎng)時間等措施，能夠最大限度地降低異常苗的發(fā)生，提高其成苗率。

馬鈴薯組織培養(yǎng)苗的培育已形成相當(dāng)規(guī)模，是完善種薯繁育體系的必備步驟，但是長期以來，組織培養(yǎng)多數(shù)還停留在試驗(yàn)研究上，在應(yīng)用生產(chǎn)方面還有一定不足，在工廠化、商品化生產(chǎn)的浪潮中，不能盲目生產(chǎn)，一踴而上，否則將導(dǎo)致其產(chǎn)業(yè)化的失敗，組培業(yè)不但不能穩(wěn)定發(fā)展，反而會倒閉破產(chǎn)，最終使馬鈴薯產(chǎn)業(yè)不能蓬勃發(fā)展，因此，今后需要有一套可行的措施，將研究成果轉(zhuǎn)化為有經(jīng)濟(jì)價值的大規(guī)模生產(chǎn)實(shí)踐。 實(shí)行馬鈴薯組培苗的標(biāo)準(zhǔn)化培育，以確保馬鈴薯組培苗的持續(xù)應(yīng)用發(fā)展和馬鈴薯種植業(yè)的不斷發(fā)展。而且組織培養(yǎng)大多停留在人工操作水平上，沒有實(shí)行機(jī)械化操作，費(fèi)時費(fèi)力，而且操作期間酒精味濃烈，空氣不清新，不利于人體健康。

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