CⅢ-1菌株胞外抗菌蛋白防治香蕉炭疽病研究

摘 要：為明確紅樹內生細菌CⅢ-1菌株的抗菌蛋白對香蕉炭疽病的控制作用，采用平板對峙法結合顯微觀察測定其對致病菌的抑制活性，進行抗菌蛋白對香蕉炭疽病的防病試驗，并測定了香蕉果實內丙二醛的含量及防御酶活性的變化。結果表明，CⅢ-1抗菌蛋白粗提液噴霧后立即接種香蕉炭疽病菌，處理8d后其防治效果達71.44％，10d后防效仍有56.67％；防病機制測定表明，(1)CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌的菌絲生長及分生孢子萌發等具有極強的抑制作用，處理后的病菌菌絲出現腫脹、膨大、成泡囊狀畸形，分生孢子基本不萌發。(2)抗菌蛋白處理香蕉后，與對照比，抗菌蛋白處理的香蕉丙二醛(MDA)的含量較低，同時過氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等活性也均有不同程度的變化。

關鍵詞：香蕉；抗菌蛋白；炭疽病；生物防治；機制

中圖分類號：$668.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)04-580-05

香蕉是華南地區的大宗果品之一，其營養豐富甜滑香濃，深受人們的喜愛。炭疽病是危害香蕉生產的主要病害之一，嚴重影響蕉果質量與商品價值。而利用化學殺菌劑控制病害，會造成嚴重的污染及危害。我國政府一直對食品安全性高度重視，目前已禁止使用多種化學殺菌劑，而不使用或者少用化肥農藥的綠色水果亦深受廣大消費者歡迎，同時，國外貿易壁壘也迫使我國必須開發安全、無公害、高效的果蔬防腐保鮮劑?？梢娧兄莆⑸锓栏ｕr劑對減少果品中農藥殘留、保護環境、提高經濟效益等多個方面都具有十分現實的意義。CⅢ－1菌株是本實驗室從湛江紅樹植物木欖葉片中分離到的1株植物內生解淀粉芽孢桿菌，該菌產生的胞外抗菌蛋白，對多種動植物病原菌具有較強的拮抗性，且對辣椒青枯病具有較好的防治效果。我們以CⅢ-1菌株產生的抗菌蛋白為研究材料，對其防治香蕉炭疽病的作用及其機理進行研究，為海洋微生物用于香蕉采后病害的生物防治、保鮮制劑的研制與開發應用等提供理論與實踐依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

供試CⅢ－1菌株：為本實驗室從紅樹植物一木欖(Bruguieragymnorrhiza)葉片體內分離獲得的內生海洋細菌，經鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amy-loliquefaciens)，該菌不僅對番茄青枯菌(Rdstoniasolanacearum)、香蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和豬鏈球菌(Streptococcus suis)等多種動植物病原菌具有拮抗作用，而且證明其抗菌物質主要是蛋白類，且發現在33％硫酸銨飽和度下凝聚沉淀提取的菌株胞外蛋白液的抗菌活性最強。為此，研究以33％硫酸銨飽和度下凝聚沉淀提取的CⅢ-1菌株胞外抗菌蛋白液為材料，進行試驗。供試病原菌香蕉炭疽菌(C.musae)為本實驗室分離保存。

1.2 供試培養基

PSA液體培養基，NA培養基，改良PDA培養基(馬鈴薯200g，葡萄糖20.0g，蛋白胨5g，瓊脂18g，水1000mL，pH自然)。

1.3 抗菌蛋白的制備及濃度測定

挑取平板培養的CⅢ-1菌株單菌落，接種于PSA液體培養基。培養18h后，按4％接種于PSA液體培養基，25℃培養96h。將培養液在10000r·min^-1條件下離心20min后取其上清液，并用孔徑為0.22um濾膜過濾，用33％硫酸銨飽和度沉淀其蛋白，經透析，即為菌株抗菌蛋白提取液，于20℃冰箱保存備用。

可溶性蛋白的含量測定采用考馬斯亮藍顯色法測定抑菌蛋白的濃度。通過蛋白標準曲線換算得到濃度。

1.4 CⅢ-1抗菌蛋白防治香蕉炭疽病效果測定

選健康無病、果個均勻、發育期基本一致的蕉果，用自來水沖洗表面后，晾干，均勻涂抹抗菌蛋白液，單果分開放入塑料盆中，待果面液體自然晾干后立即噴霧接種香蕉炭疽病分生孢子懸浮液(濃度約10⁶孢子·mL^-1，28℃下保濕培養。以清水PBS緩沖液處理為對照，3d后調查發病情況。

1.5 香蕉炭疽病病情指數分級標準

0級：無病斑；1級：果面有零星病斑，柄部開始變黑，果柄見極少量菌絲；2級：果面病斑較多，病斑數5～10，柄部基本變黑，出現白色菌絲；3級：果面有大量病斑，柄部全部變黑，出現紅色孢子堆；4級：果面有大量病斑，柄部全部變黑，蕉果開始腐爛；5級：果面布滿病斑，果體松軟腐爛，果柄易折斷。

1.6 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌菌絲生長的影響

將香蕉炭疽病菌接種在PDA平板培養基上，對峙點接CⅢ－1菌株抗菌蛋白提取液，培養出現抑菌圈后，挑取菌落邊緣菌絲，鏡檢菌絲生長狀況，以無菌水及0.01mo1·L^-4，pH6.8的PBS緩沖液為對照。

1.7 CⅢ-1抗菌蛋白對病菌分生孢子萌發的影響

用將CⅢ-1菌株抗菌蛋白溶液(25.99g·L^-1)配制香蕉炭疽病菌分生孢子懸浮液，用載玻片懸滴法28℃下培養24h，以無菌水及PBS緩沖液為對照，計算分生孢子萌發率。

1.8 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉內MDA含量及POD和PAL等防御性酶活性測定

設CⅢ-1菌株抗菌蛋白、PSB緩沖液和清水等3個處理，選取果實和處理方法同1.4，處理后每隔24h取1次樣，分別測定各處理香蕉內MDA含量、POD和PAL等防御性酶活。其中MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，POD酶活性采用愈創木酚法，PAL酶活性參照陳建勛的方法。

2 結果與分析

2.1 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉果炭疽病的防治效果

CⅢ-1抗菌蛋白防治香蕉果炭疽病測定結果表明(表1)，用CⅢ-1抗菌蛋白涂抹蕉果后立即接種病原菌8、9和10d的防治效果分別為71.44％、57.14％和56.67％，接種12d后抗菌蛋白的防病效果仍有33.33％(資料未顯示)。實驗中發現，用抗菌蛋白處理后，不僅病害發生輕，而且蕉果表面較光滑(圖1)。由此可見，CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉果實炭疽病具有較好的防治效果，對香蕉具有一定的保鮮作用。

2.2 不同濃度抗菌蛋白提取液對香蕉炭疽病的防治效果

不同濃度蛋白提取液對香蕉炭疽病的防治效果表明(圖2)，蛋白提取液的防病效果與蛋白濃度呈正相關，蛋白濃度越高，防病效果越明顯。

2.3 CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌菌絲生長的影響

測定結果表明(圖3)，對峙生長4d后，香蕉炭疽病菌生長直徑只有(1.15±0.05)cm，而清水及PBS對照香蕉炭疽病菌生長直徑已達到(5.2±0.1)cm。靠近菌株邊緣處病菌菌絲不僅不能向外擴展生長，而且變黑，形成一條黑色條帶，鏡檢發現其菌絲形態出現腫脹、膨大、成泡囊狀畸形。說明CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病菌菌絲生長有抑制作用。

2.4 CⅢ-1抗菌蛋白對病菌分生孢子萌發的影響

病菌分生孢子萌發測定結果表明，CⅢ-1抗菌蛋白處理后，分生孢子100％不萌發。而PBS及清水對照中分生孢子的萌發率分別達91.5％和95.83％，由此可見，CⅢ-1抗菌蛋白對香蕉炭疽病孢子的萌發具有極強的抑制作用。

2.5 丙二醛(MDA)含量測定

各處理蕉果丙二醛(MDA)含量變化測定結果表明(圖4)，抗菌蛋白處理的蕉果，MDA含量變化平穩，且量值均比對照低；處理后7d對照的MDA含量開始迅速上升，這與病害發生情況基本吻合。表明寄主體內MDA含量與寄主細胞的損傷程度相關，這與前人研究結果相符。說明抗菌蛋白處理可降低寄主體內MDA濃度的增加，減小病菌對寄主細胞的損害。

2.6 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定

各處理蕉果體內苯丙氨酸解氨酶(PAL)變化趨勢明顯不同，對照處理PAL酶活均比抗菌蛋白處理的高。對照在處理后9d內，其PAL酶活均呈現上升趨勢，而抗菌蛋白處理5d內，其PAL酶活呈現下降，之后再上升(圖5)。抗菌蛋白處理的蕉果PAL酶活力曲線趨勢相對平穩，說明抗菌蛋白處理后，寄主體內各保護酶類的產生及活性變化不大，對寄主損傷較小，寄主可以保持正常的生理生化狀態，可見，CⅢ-1抗菌蛋白對寄主保持正常生理生化狀態，提高寄主抗病性，減輕病害發生程度具有一定的作用。

2.7 過氧化物酶(POD)活性測定結果

各處理蕉果過氧化物酶(POD)活力變化結果表明(圖6)，各處理POD酶活力變化基本相似。無菌水處理后3d達到高峰，而后迅速下降。其中以無菌水處理的POD酶活曲線整體變化幅度大，說明無菌水處理的POD酶活性變化大，超氧自由基，H_{2O2或者過氧化物產生較多，代謝紊亂，對宿主傷害較大。而抗菌蛋白處理的蕉果，在3d出現酶活高峰后緩慢下降并保持在較低水平，蕉果保持正常的代 謝生理狀態，說明CⅢ-1菌株抗菌蛋白對提高宿主抗病能力可能具有一定的作用。}

3 討論

關于果蔬采后病害生物防治的生防菌，目前多來源于植物體內或其體表。國內外對拮抗菌控制采后病害研究最多的是酵母菌、假單孢菌及芽孢桿菌。其中，芽孢桿菌是一類在自然界廣泛存在的重要微生物類群，其突出的特征是能產生抗逆性極強的芽孢，這有利于芽孢桿菌作為生防菌株的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖和繁殖，而將海洋微生物用于果蔬采后病害防治，目前還未見有相關報道。近年來的研究表明，海洋中不僅存在著可以分泌產生大量具有生物學活性的物質微生物，甚至許多以前認為是由海洋植物或無脊椎動物產生的活性物質，其真正來源是由與之共附生的微生物所產生的。關于海洋微生物活性物質，近年來已開始有將海洋微生物用于農業生產上的研究報道。紅樹林及其共附生海洋微生物，目前已有研究報道，紅樹生態系統是海洋微生物生長繁衍的溫床，其體內外及根際土壤中均存在有大量的微生物，本實驗室從紅樹林多個品種中分離篩選到大量對植物病原菌具有良好抑制作用的海洋細菌，表明了紅樹共附生微生物不僅數量、種類多，且在植物病害生防中具有獨特的優勢。

實驗采用來源于紅樹植物木欖葉片內生細菌CⅢ-1胞外抗菌蛋白為實驗材料，對CⅢ-1胞外抗菌蛋白防治香蕉采后炭疽病進行了研究，獲得良好的防病效果。由此可見，紅樹內生細菌可能具有十分重要的研究和開發應用價值，對此值得進一步研究，為海洋微生物在農業病蟲害生物防治中的應用提供基礎。