生物肥防治香蕉枯萎病及對土壤微生物多樣性的影響

摘 要：通過盆栽試驗比較堆肥、生物有機肥和生物復混肥3種肥料滅菌前后對粉蕉(Musaparadisica，AAB)促生和枯萎病防病效果，采用BiologEco微平板方法研究不同肥料對土壤微生物功能多樣性影響以及與防病關系。結果表明，所有施肥處理病情指數均比單接病原菌低，生物有機肥和生物復混肥防病效果分別為61.5％和53.8％，同相應肥料滅菌處理和堆肥比較，功能細菌在防病效果中具有重要作用。生物有機肥和生物復混肥明顯促進粉蕉生長，鮮質量分別比單接病原菌高35.0％和70.9％。Biolog結果表明，單接病原菌處理AWCD和shmmon diversity指數比空白對照高，施肥處理又不同程度低于單接病原菌，Shannon eveness指數差異不明顯。肥料防病效果與土壤微生物功能多樣性變化趨勢相反。

關鍵詞：香蕉；枯萎病；生物肥；防病效果；土壤微生物多樣性；Bi0log

中圖分類號：S668.1 文獻標識碼：A 文章編號：1009-9980(2010)04-575-05

香蕉枯萎病又稱巴拿馬病，是整個香蕉產業重要病害之一，造成的損失極大，此病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型Fusarium oxysporumf.sp.cubense(Foc)侵染引起的一種土傳維管束病害。我國香蕉枯萎病近年來有加重趨勢，發病率一般為10％～40％，嚴重時超過90％。目前香蕉枯萎病防治方法包括選育抗病品種、化學防治、生物防治以及采取適當農業措施等，在不同防治方法中，生物防治是目前公認比較安全和有效的防治措施。并且符合環境保護和有機食品要求。但是單純生防菌防病速度慢，且效果不穩定，原因是生防菌作為外來菌受土壤條件影響大，不易在土壤中繁殖和發揮效果。國外有研究者將生防菌與印楝餅渣結合使用，期望實現作用持久的抑病效果。

土壤微生物多樣性包括物種多樣性、功能多樣性和遺傳多樣性，土壤微生物功能多樣性分析中，Biolog方法最常用，該方法首先由Garland和Mills應用于土壤微生物群落研究，并認為是一種較為先進方法。研究表明土壤微生物功能多樣性和防病效果有一定相關關系，通過調控土壤微生物群落以及改變土壤微生物功能多樣性可以抑制土傳病害。生物肥是用堆肥和具有促生、防病作用功能細菌制成，功能細菌在堆肥形成的“基質”環境下能更好發揮作用，對當季和后茬作物促生效果明顯。我們通過比較生物有機肥、生物復混肥和堆肥滅菌處理前后對粉蕉枯萎病防治效果，以及Biolog Eco微平板研究土壤微生物多樣性特征差異，揭示生物肥對土壤微生物功能多樣性影響以及和防治香蕉枯萎病之間內在關系，為提高生物防治土傳病害提供思路。l材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試粉蕉品種 粉蕉(Musaparadisica.AAB)杯苗，品種為廣粉1號，廣東省農業科學院果樹研究所提供。

1.1.2 供試肥料 堆肥(OF)：用畜禽糞便和菇渣堆制發酵腐熟的有機肥，室內自然風干。含水量低于15％。

生物復混肥(BCF)：以堆肥為載體，加入具有解磷、解鉀和拮抗功能的混合液體菌劑(巨大芽胞桿菌Bacillus megaterium、膠質芽胞桿菌Bacillus mu-cilaginosus和枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis)，再加入尿素、過磷酸鈣和氯化鉀，肥料配比為(w/％)N：P₂O₅：K₂O=4：0.5：3。

生物有機肥(BOF)：僅在堆肥中加入與生物復混肥相同混合液體菌劑。3種肥料基本特征見表1。

1.1.3 供試土壤 采自華南農業大學農場，由赤紅壤發育而成水稻土壤，其主要理化性質為：砂壤土，有機質含量19.00g·kg^-1；pH7.66；全N、P、K分別為1.6g·kg^-1、0.51g·kg^-1和23.88g·kg^-1。

1.1.4 病原菌 尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種Fusarium oxysopoyum f.p.cubence race 4(Foc)，華南農業大學資源環境學院植物病理系姜子德教授提供。

1.2 試驗設計與操作過程

處理1、空白對照，不施肥，不加病原菌(CKO)，處理2、單接病原菌，不施肥(FOC)，處理3、堆肥(OF)+病原菌，處理4、滅菌堆肥(OF’)+病原菌，處理5、生物有機肥(BOF)+病原菌，處理6、滅菌生物有機肥(BOF’)+病原菌，處理7、生物復混肥(BCF)+病原菌，處理8、滅菌生物復混肥(BCF’)+病原菌。每個處理設3次重復，每個重復有4盆，每盆種植1株香蕉。

生物復混肥以N計按0.15g·kg^-1土施入，其他肥料用量按照與生物復混肥中等有機肥量計算。肥料滅菌條件為：121℃滅菌30min，間隔1d再滅菌1次。肥料分2次施入，基肥用量占總量60％，剩余40％在香蕉苗移栽15d后均勻追施在蕉苗根際周圍。

塑料盆大小為高：14cm，直徑：18cm，裝風干土2.5kg。移栽時，選擇葉片數在6～7片生長大小一致蕉苗移入塑料盆中。移栽5d后采用傷根澆入法接種病原菌，病原菌懸浮液中大分生孢子濃度約為每毫升10⁵個，每盆加入10mL。45d后收獲蕉苗，調查病情和生物產量，用Biolog Eco微平板研究蕉苗根際土壤微生物功能多樣性。

1.3 病情指數和防病效果

病情分級和調查方法參考相關文獻[12]

病情指數％=∑（各級發病數×該級代表數）/總數×最高級代表值×100

防病效果％=對照病情指數-處理病情指數/對照病情指數×100

1.4 土壤微生物功能多樣性測定

具體操作過程見文獻[13-14]。Biolog Eco微平板在Bio-Tek公司ELX808酶標儀上讀數，掃描波長為595nm。平均每孔顏色變化率AWCD(Averagewell color development)計算方法如下：AWCD值=〔∑(C-R)〕/31，其中C指各反應孔吸光值，R是對照孔吸光值，其他多樣性指數計算如表2。所有試驗

數據用Excel 2003和SAS8.1統計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 生物肥對枯萎病防治效果

本試驗中粉蕉在接種病原菌20d后出現枯萎病病癥，文獻報道粉蕉對枯萎病4號生理小種有一定抗性，但是人工接種病原菌條件下發病情況與其他品種差異較小。收獲時調查枯萎病病情，空白對照沒有感病，施肥與單接病原菌處理均不同程度出現枯萎病癥狀(圖1)。單接病原菌蕉苗感病最嚴重，其他處理比單接病原菌低，生物有機肥病情指數最低，其次是生物復混肥，2種生物肥料處理病情指數顯著低于單接病原菌，表明生物肥對枯萎病有一定抑制作用。堆肥處理與單接病原菌病情指數接近，差異不顯著。3種肥料滅菌后，病情指數都比正常肥料處理高。根據病情指數計算防病效果，生物有機肥防病效果為61.5％，效果最好，生物復混肥53.8％，堆肥防病效果幾乎為0。生物有機肥和生物復混肥滅菌后，仍然有一定防病效果，可能與肥料中功能芽胞細菌的抗病代謝產物有關。

2.2 生物肥對粉蕉植株促生作用

粉蕉收獲后，測定株高和地上部鮮質量(表3)，對照蕉苗株高和鮮質量顯著高于單接病原菌處理，結果表明蕉苗感染了病原菌后生長受到嚴重影響。3種肥料都能促進生長，堆肥株高和鮮質量比單接病原菌增加6.8％和17.8％，生物有機肥比單接病原菌增加14.7％和35.0％，顯著高于堆肥，生物復混肥促生效果最好，株高和鮮質量分別比單接病原菌增加25.2％和70.9％，比生物有機肥增加9.2％和26.7％，差異都達顯著性。肥料滅菌后蕉苗株高和鮮質量均比不滅菌處理差。

比較不同肥料防病和促生效果，堆肥、生物有機肥和生物復混肥都能不同程度減輕枯萎病癥狀，生物有機肥防病效果最強，與3種功能細菌含量密切相關；生物復混肥促生效果最好，表現出3種肥料復合優勢。

2.3 對土壤微生物功能多樣性影響

目前絕大部分學者應用培養72h Biolog數據進行土壤微生物群落功能多樣性研究，因為大部分微生物在72h時處于對數生長期，最能體現微生物多樣性差異。本研究中單接病原菌AWCD比空白對照高(表4)，但差異不顯著。生物有機肥AWCD最小，顯著低于單接病原菌。堆肥和生物復混肥AWCD都比單接病原菌小，有些差異達到顯著性。除生物復混肥外，其他2種肥料滅菌處理AWCD均比不滅菌肥料處理高，其中原因有待進一步研究。整體看。接人病原菌提高了土壤微生物AWCD，施肥降低了AWCD。比較不同處理對shannon diversity影響，生物有機肥最低，生物復混肥也略低于單接病原菌。此結果與李勝華等和譚兆贊等㈣研究番茄青枯病不同，說明Biolog方法測定土壤微生物多樣性指數可能與生物肥和土傳病害種類有關(原因分析見另文)。shannon eveness與shannon diversity趨勢相反，生物有機肥最高，空白對照和生物復混肥最低，但處理之間差異不顯著。

2.4 土壤微生物功能多樣性主成分分析

土壤微生物功能主成分分析(Principal Compo－nent Analysis，PCA)用于研究土壤微生物對不同碳源利用差異，圖2為不同處理Biolog Eco微平板上31種碳源底物利用分布情況。從圖可以看出，第一主成分PCI(34.5％)對群落的貢獻遠大于第二主成分PC2(9.11％)，單接病原菌位于PCI正端方向最大位置處，而空白對照和其他處理都分布在比單接病原菌小的位置處。在PC2方向上，空白對照和單接病原菌處理在正端，其他施肥處理都在負端，表現出了內在一致性，說明施肥對土壤微生物影響在某個方面具有高度相似性，但是這種相似性和土壤微生物群落特征以及防病效應之間存在什么關系，還需要進一步研究。

3 討論

堆肥含有較高腐殖質，吸附能力也較強，同時還有大量廣譜抗病有益微生物和活性物質，將堆肥與Bacillus subtilis、Paenibacillus polymyxa、Tricho-derma asperellum等生防微生物結合防治土傳病害，效果比單獨更好，這種結合已成為生物防治土傳病害重要方法。本試驗中生物有機肥和生物復混肥防病效果比堆肥好，表明功能細菌在防病效果中起重要作用。肥料滅菌處理后，仍然具有一定防病作用，與抗病代謝產物熱穩定性有關。試驗中所用枯草芽胞桿菌(acillus subtilis)胞外抗病活性物質在100℃煮沸20min抑制Foc能力不變，高溫高壓滅菌條件下，抗病活性下降10％左右。因此，在土傳病害蔓延土壤上，將生防微生物與堆肥結合制成不同生物肥，可以有效減輕病害發生程度。

在BiologEco主成分分析中，3種肥料處理分布具有高度相似性，主要集中在左下區域，AWCD比單接病原菌低，表明施肥與土壤微生物群落結構變化緊密相關：生物肥進入土壤，會增加或減少某些微生物種類和數量，改善土壤微生物群落組成，以此來抑制病原菌生長。對于應用Biolog Eco技術分析土壤微生物功能多樣性還存在一些問題，如土樣稀釋濃度以及濁度、培養溫度、時間等不同，對碳源底物理解和分類差異大，這些問題影響該技術對土壤微生物功能多樣性精確分析。同時僅依賴此方法還不能充分認識土壤環境微生物多樣性和復雜性，需要采用多種研究方法從不同角度深入認識土壤微生物多樣性變化，以及和病害程度相互關系。

4 結論

比較堆肥、生物有機肥和生物復混肥防病效果，生物有機肥最好，防病效果為61.5％，這和它含有大量功能細菌有關；生物復混肥是不僅具有一定防病效果，而且在短時間內還能提供植物所需速效養分，有利于植物生長，具有促生和防病雙重作用。通過Biolog方法研究土壤微生物功能多樣性發現，施用3種肥料后，AWCD均比病原菌低，可能是施肥調整了土壤微生物群落結構，抑制了一些微生物活性，突出了特定微生物功能作用。