草地早熟禾新格萊德胚性愈傷組織原生質體培養及植株再生的研究

趙小強,馬暉玲＊ ,林棟,周萬海,吳翔

(1.甘肅農業大學草業學院,甘肅蘭州 730070;2.草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅蘭州 730070;3.中-美草地畜牧業可持續研究中心,甘肅 蘭州730070)

草地早熟禾(Poa pratensis)為北方主要的冷季型草坪草。其品種新格萊德因具有株體低矮、持綠期長;生活力強、經久耐用、極耐踐踏;耐低修剪;極耐寒、抗旱性超群;抗病蟲力突出等特點而被廣泛應用于草坪綠地的建植。以新格萊德作為一種優良的親本材料,通過以原生質體培養為基礎的細胞融合技術來改良草地早熟禾其他常見栽培品種的性狀特性,獲得雜種優勢后代,達到草地早熟禾優良品種選育的目的。迄今為止,細胞融合技術已成為改良植物性狀的重要手段,而從原生質體獲得再生植株是進行細胞融合的先決條件[1]。Vander等[1]建立了草地早熟禾的原生質體懸浮培養體系,獲得了白化苗;隨后Kirsten等[2]也建立了草地早熟禾品種“Geronimo”的懸浮培養體系,并以此懸浮細胞體系為材料獲得原生質體和再生植株。

本研究從草地早熟禾品種-新格萊德成熟種子中誘導出愈傷組織,并經多次繼代培養產生松軟的胚性愈傷組織,再從中游離出原生質體,經原生質體培養,獲得再生綠苗。這一研究成果對于進一步進行草地早熟禾體細胞雜交和外源基因的轉化提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 愈傷組織的誘導、繼代以及胚性愈傷組織的篩選

于2007年3月至2008年11月,選取草地早熟禾品種新格萊德(Nuglade)成熟種子,滅菌后接種于含3.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L 6-BA的MB5(MS大量+MS微量+B5有機+鐵鹽+蔗糖+瓊脂)培養基上誘導愈傷組織,選淡黃色或鮮黃色的愈傷組織在相同的培養基中進行繼代增殖。每15～20 d繼代1次,連續繼代10～12次后,大部分大顆粒淡黃色的胚性愈傷組織轉變為淡黃色易分散的小顆粒,最終成為穩定的細胞系,然后取此類愈傷組織,用于原生質體的分離。胚性愈傷組織的誘導和繼代培養在黑暗、(25±1)℃條件下進行。

1.2 原生質體的分離與其純化

從在固體培養基上繼代培養了7～9個月、更換新鮮培養基培養了8～10 d的新格萊德愈傷組織細胞系中取1 g左右的材料,于10 mL混合酶解液中分離原生質體。在本研究中設置了4個酶處理組合。

Ⅰ:1%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10(Yakult,日本Japan),1%離析酶Macerozyme R-10(Yakult,日本Japan);

Ⅱ:1%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10(Yakult,日本Japan),1%離析酶Macerozyme R-10(Yakult,日本Japan),0.3%崩潰酶Driselase(Sigma);

Ⅲ:1%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10(Yakult,日本Japan),1%離析酶 Macerozyme R-10(Yakult,日本Japan),0.3%崩潰酶Driselase(Sigma),0.3%果膠酶Pectolase Y-23(Yakult,日本Japan);

Ⅳ:1%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10(Yakult,日本Japan),1%離析酶Macerozyme R-10(Yakult,日本Japan),0.3%崩潰酶Driselase(Sigma),0.5%果膠酶Pectolase Y-23(Yakult,日本Japan)。

其中酶溶劑(CPW-13,mg/L)為:KH2PO4(27.2)、KNO3(101.0)、CaCl2·2H2O(1 480.0)、MgSO4·7H2O(246.0)、KI(0.16)、CuSO4·5H2O(0.025)、5.0 mmol/L 2,(N-嗎啡啉)-乙基磺酸、13%甘露醇,pH 5.8。經0.45 μ m微孔濾膜過濾滅菌。

在(26±1)℃黑暗條件下,將愈傷組織加入不同的酶液中靜置30 min,然后在50 r/min的搖床上震蕩,進行酶解。每隔2 h設置1個酶解時間段,并且每2 h測定分離出的原生質體產量和活力,以確定適宜的酶解時間。

酶解材料經200、300目無菌尼龍網篩過濾,除去沒有酶解完全的組織和細胞團,濾液經250 r/min離心5～10 min收集原生質體。用酶溶劑CPW-13(成分同上)懸浮,再離心,這樣反復2～3次。最后用原生質體培養液洗滌2次。

1.3 原生質體的培養和植株再生

將經洗滌的原生質體重新懸浮于原生質體培養基中,調整密度到2×105～5×105個/mL。原生質體培養介質采用常用的KM8P[4]基本培養基,含3.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L 6-BA、100 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L水解乳蛋白、1%蔗糖、0.4 mol/L甘露醇、pH為5.8。吸取2 mL原生質體懸浮液于直徑為6 cm的培養皿中,在(26±1)℃,黑暗條件下液體淺層靜置培養。在第7和14天時更換甘露醇濃度依次減半的新鮮的培養基。4周之后將形成的肉眼可見的小愈傷組織轉移到除去甘露醇的培養基進行培養。將長至2 mm左右的小愈傷組織轉移至含3 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L 6-BA的MB5培養基繼續進行培養,然后轉移至含0.5 mg/L NAA、5 mg/L 6-BA的MS分化培養基上培養。

1.4 原生質體活性的檢測

吸取1滴原生質體懸浮液置于載玻片上,在熒光顯微鏡下檢測其活性。采用熒光素雙醋酸酯(FDA)進行染色。FDA 用丙酮配制成5 mg/mL溶液,然后按照25 μ L FDA/mL進行染色,靜置5 min后觀察,隨機選取3個視野統計原生質體的數量。

2 結果與分析

2.1 胚性愈傷組織的誘導、繼代以及胚性愈傷組織的篩選

成熟種子在誘導培養基中培養4周后,即可誘導形成大量的愈傷組織,選取淡黃色或鮮黃色的愈傷組織(圖1-1)在相同的培養基中進行繼代培養,繼代培養時去除水漬狀的愈傷組織(圖1-2)。15～20 d繼代1次,繼代10～12次后,愈傷組織外觀呈淡黃色或鮮黃色顆粒型,質地較緊密,且用無菌水將其懸浮在倒置顯微鏡下觀察,此時愈傷組織的細胞大多數為細胞質濃、等徑、壁薄、核大、分裂旺盛,最終成為穩定的細胞系(圖1-3)。試驗證明,從這種愈傷組織能夠分離出大量的原生質體。

2.2 原生質體的游離

2.2.1 供試材料的選擇 選取活力旺盛的胚性愈傷組織是草地早熟禾新格萊德原生質體游離與培養成功的關鍵。研究發現,活力旺盛的愈傷組織在酶解時可獲得較多且生命力強的原生質體(圖1-4),且獲得的原生質體在培養過程中且容易分裂,本試驗所得的結論與王喆之等[3]的結論是一致的。

2.2.2 適宜的酶液成分的選定 經多次繼代的淡黃色胚性愈傷組織細胞系處于旺盛生長期,取此類愈傷組織于混合酶中游離原生質體。經50 r/min震蕩可得大量的原生質體。在游離原生質體時,不同的酶液組成(表1)以及酶解時間對原生質體的產量和活力都有很大的影響,經試驗得到最佳的酶液組合為:1%纖維素酶Cellulase Onozuka R-10、1%離析酶Macerozyme R-10、0.3%崩潰酶Driselase、0.5%果膠酶Pectolase Y-23。

圖1 草地早熟禾新格萊德原生質體培養及其植株再生Fig.1 Protoplasts culture and plant regeneration in Nuglade(P.pratensis)

2.2.3 最佳酶解時間的確定 本研究表明,酶解時間少于14 h時,原生質體的產量及其活力較低,均少于酶解14 h時的產量和活力26.7×105個/g,71.2%。當酶解時間超過18 h時,原生質體的產量為23.3×105個/g,但是活力下降下降到68.3%,不利于原生質體的培養(表2)。酶解時間以14～16 h為好。

2.2.4 滲透壓的調節 酶和酶解時間是游離原生質體的主要因素,但酶液中滲透壓穩定劑在原生質體的游離中也起到很關鍵的作用。在原生質體的分離中,常加入0.35～0.80 mol/L的甘露醇、葡萄糖、蔗糖或山梨醇來調節酶液的滲透壓[4]。本試驗在酶液中加入了0.40 mol/L甘露醇,有效地提高了原生質體的釋放量和穩定性。

2.2.5 適宜的繼代培養天數確定 在上述酶解條件下,研究了愈傷組織不同繼代培養時間對原生質體分離效果的影響(圖2)。結果表明,繼代培養第9天時,可獲得大量的具有活力的原生質體(圖1-5),并且多數細胞質較濃,在以后的培養中易于分裂。因此,繼代培養時間定為8～10 d。

2.3 原生質體的培養和植株再生

2.3.1 原生質體再生細胞的分裂 原生質體在KM8P基本培養基中培養2～3 d后,可觀察到原生質體再生細胞的第1次、第2次和第3次分裂(圖1-6,1-7,1-8)。隨后可觀察到再生細胞的持續分裂,并形成小細胞團(圖1-9)。第9～10天時,在倒置顯微鏡可觀察到幾十個和上百個細胞的細胞團。培養2周后,原生質體持續分裂形成約10個細胞組成的細胞團。4周后,原生質體產生肉眼可見的小愈傷組織(圖1-10)。

2.3.2 滲透壓對原生質體分裂和生長的影響 添加滲透壓減半的新鮮培養基有利于細胞的增殖。從試驗中觀察到,在培養過程中,滲透壓對草地早熟禾的原生質體培養的影響很大。原生質體培養到第1周時,此時添加滲透壓不變的新鮮培養基繼續培養,1周之后在倒置顯微鏡下可以看到細胞的分裂速度很慢,相比較,在添加滲透壓減半的繼代培養中原生質體的分裂現象特別明顯;培養到第2～3周時,更換滲透壓再次減半的新鮮培養基,此時可以觀察到較多的小細胞團,且大部分形成小愈傷組織,而滲透壓沒變的培養皿中的細胞只是停留在小細胞團的水平,很少形成愈傷組織。試驗表明,在原生質體的培養過程中及時地補添低滲的培養基,可有力于原生質體的培養,這同Sun等[5]、蔡起貴等[6]和王喆之等[3]在玉米(Zea mays)和陸地棉(Gossypium hirsutum)原生質體培養中所得到的結果是一致的。

表1 不同的酶液組成對草地早熟禾新格萊德原生質體產量和活力的影響Table 1 The effect of different enzymes compositions on the yield and viability of protoplasts from Nuglade(P.pratensis)

表2 不同的酶解時間對草地早熟禾新格萊德原生質體產量和活力的影響Table 2 The effect of different the time of enzyme digestion on the yield and viability of protoplasts from Nuglade(P.pratensis)

隨著原生質體細胞壁的形成和細胞的持續分裂,滲透壓的濃度需要不斷的降低,這樣才有利于細胞的增長。

2.3.3 植株再生 當原生質體來源的愈傷組織長至2 mm左右時將其挑出接種到固體培養基上繼代擴增,繼代2次后可得胚性較強的愈傷組織(圖1-11)。培養30 d后將其再轉移至分化培養基上分化。30 d后供試的49塊愈傷組織中,有5塊分化出了芽,芽分化率為10.2%,且進一步生根形成完整的植株(圖1-12)。

圖2 草地早熟禾新格萊德愈傷組織繼代時間對原生質活力的影響Fig.2 Effect of callus age on the viability of protoplast from Nuglade(P.pratensis)embryogenic calli

3 討論

3.1 供體材料對原生質體培養的影響

有關草坪草原生質體的培養和體細胞雜交的研究及其進展,在國外已有相關的報道[1,2,7,8-10]。Dalton[8]從懸浮培養高羊茅(Festuca arundinacea)和多年生黑麥草(Lolium perenne)的原生質體中獲得了再生植株;Wang等[9]建立了牛尾草(Festuca pratensis)的原生質體懸浮培養體系,產生了可育的綠色小苗;Inokuma等[10]以根尖頂端分生組織為外植體,建立了結縷草(Zoysia japonica)的原生質體植株再生體系。

禾本科植物原生質體培養獲得成功的試驗,幾乎都是用幼胚、成熟胚誘導形成的胚性愈傷組織或胚性懸浮細胞來游離原生質體,但是建立胚性懸浮細胞途徑存在兩點不足:一是隨培養時間的延長,細胞全能性迅速下降乃至喪失;二是懸浮培養過程極易使培養物發生大量變異致使難以保證再生出正常可育植株,這樣給試驗帶來很多不便。Kirsten等[2]成功獲得草地早熟禾品種“Geronimo”綠苗的關鍵是建立了愈傷組織胚性細胞懸浮系。本研究從草地早熟禾成熟種子中誘導出愈傷組織,以繼代10～12次后的胚性愈傷組織為材料獲得了活力較強的原生質體且進一步進行了培養,成功再生出新植株。

該研究認為,采用活力旺盛的胚性愈傷組織是草地早熟禾新格萊德原生質體再生植株的重要環節。經過多次繼代培養所得的松軟淡黃色或鮮黃色的愈傷組織細胞系適宜于原生質體的游離和培養。但是此過程需要較長時間。因此探討采用何種措施來縮短繼代培養的時間而獲得適合于原生質體的游離細胞系是十分必要的。

3.2 酶液組成、濃度和酶解時間對原生質體分離的影響

酶解液的組成、濃度和酶解時間在原生質體培養中也是一個重要的技術環節。若酶液濃度過高,會導致原生質體的死亡;若濃度過低,卻不利于原生質體的釋放。王喆之等[3]、姜淑慧等[11]和王瑛華等[12]在試驗中通過篩選得到了酶解陸地棉、播娘蒿(Descurainia sophia)和霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的最佳酶解組合。酶解時間太短,游離的原生質體量少且不能滿足試驗的需求,時間過長又會對原生質體產生傷害[13]。劉強等[14]試驗發現采用2%纖維素酶+0.5%半纖維素酶+0.5%果膠酶的混合酶酶解12 h可獲得高質量的黃芪(Astragalus membranaceus)的原生質體。因此,適當的酶液組合在最佳的時間可更有利于原生質體的釋放,在本研究中得出原生質體在1%纖維素酶+1%離析酶+0.3%崩潰酶+0.5%果膠酶酶液組成在14～16 h可獲得產量較高且活力較強的原生質體。

3.3 滲透壓對原生質體培養的影響

在植物原生質體的培養中,培養基的滲透壓一般需要逐步降低。在獼猴桃原生質體培養成功的幾例報道中[15,16],培養基的濃度是逐步降低的。但Binding等[17]在其試驗中是一步降低的。本研究采取滲透壓逐步降低的方法獲得了較好的效果。此外,滲透調節物質的組合使用可以提高愈傷組織的形成率,本試驗中采用甘露醇、葡萄糖和蔗糖組合來調節滲透壓,使細胞維持在高滲狀態下,導致質壁分離,利于酶解,并且得到了較多的愈傷組織,這與何道一和孫山[18]在蘋果(Malus domestica)單倍體原生質體培養結果相似。

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[18]何道一,孫山.蘋果單倍體原生質體培養再生植株[J].核農學報,2004,18(6):411-415.