水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品中三聚氰胺檢測(cè)方法的研究

梁寶愛 張素娟

（國(guó)家農(nóng)副加工產(chǎn)品及白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、山西省食品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)督中心，太原 030012）

水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品中三聚氰胺檢測(cè)方法的研究

梁寶愛*張素娟

（國(guó)家農(nóng)副加工產(chǎn)品及白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、山西省食品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)督中心，太原 030012）

采用氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GCMS/MS） 對(duì)鮮、冷或凍水產(chǎn)品（養(yǎng)殖魚、蝦、蟹、貝等） 及水產(chǎn)制品（干、熏、鹽制水產(chǎn)） 中三聚氰胺進(jìn)行了檢測(cè)。樣品采用乙睛和甲醇提取，提取液離心凈化，氮?dú)獯蹈桑醚苌噭〣STFA-TMCS（體積比為 99∶1） 進(jìn)行衍生化反應(yīng)、優(yōu)化儀器條件、考察基體干擾，利用三重四級(jí)桿氣相色譜聯(lián)用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 技術(shù)，對(duì)三聚氰胺衍生物進(jìn)行定性定量分析。以三聚氰胺衍生物離子對(duì)m/z 342＞171、m/z 342＞327離子對(duì)進(jìn)行定性，以m/z 342＞327進(jìn)行定量。方法的線性范圍為 0.005 μg/L ～ 0.1 μg/L；回歸方程為y=1 434 164.378 8x-704.012 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4；方法定量限0.03 mg/kg。回收率達(dá)90%以上，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5.0%。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，適合于水產(chǎn)品和水產(chǎn)制品中三聚氰胺含量的確證和定量測(cè)定。

水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品；三聚氰胺；檢測(cè)；氣相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法

食品安全直接危害人民群眾身體健康和生命安全，危及企業(yè)生存，甚至影響我國(guó)產(chǎn)品聲譽(yù)、國(guó)際貿(mào)易和國(guó)家形象。乳制品中三聚氰胺事件的出現(xiàn)，企業(yè)缺乏自律是根本，但缺乏檢測(cè)方法和手段，以至于無法查處這些違法添加物也是重要的原因之一。2008年10月，香港市場(chǎng)上從內(nèi)地進(jìn)口的雞蛋中檢測(cè)出三聚氰胺，香港對(duì)內(nèi)地進(jìn)口雞蛋開始全面檢測(cè)，并將檢測(cè)范圍擴(kuò)大至從內(nèi)地進(jìn)口的肉類及動(dòng)物內(nèi)臟。因此，盡快開發(fā)出相應(yīng)的檢測(cè)方法，對(duì)其他動(dòng)物源性食品中三聚氰胺的檢測(cè)和監(jiān)控具有很重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要試劑

甲醇、乙腈、三氯甲烷，均為色譜純；吡啶，分析純；衍生化試劑，N，O－雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA） +三甲基硅烷（TMCS），體積比為99∶1；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（C3H6N6），純度≥99.0 g/100 g。

1.2 主要儀器

Agilent 7100氣相色譜-質(zhì)譜 /質(zhì)譜（GC-MS/MS）儀：配有電子轟擊電離離子源（EI）；分析天平，感量0.01 g和0.000 1 g；高速萬能粉碎機(jī)；渦旋混合器；勻漿機(jī)；超聲波水浴；高速冷凍離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于4 000 r/min；氮?dú)獯蹈蓛x；電熱恒溫干燥箱；具塞塑料離心管。

1.3 試樣前處理

1.3.1 水產(chǎn)制品

準(zhǔn)確稱取粉碎混勻的試樣1 g（精確到0.01 g），加入10.00 mL乙腈水或甲醇水，渦旋混勻2 min后超聲提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min離心10 min，取上清液用直徑0.2 μm微孔濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取200 μL濾液，50℃下氮?dú)獯蹈桑苌蟠郎y(cè)。

1.3.2 水產(chǎn)品

準(zhǔn)確稱取混勻試樣1 g（精確到0.01 g，試樣取可食部分切碎混勻），加入10.0 mL乙腈或甲醇，渦旋混勻2 min后超聲提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min離心10 min，取上清液用直徑0.2 μm微孔濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取200 μL濾液，50℃下氮?dú)獯蹈桑苌蟠郎y(cè)。

1.3.3 衍生化

取上述氮?dú)獯蹈蓺埩粑铮尤?00 μL吡啶和200 μL衍生化試劑，混勻，70℃反應(yīng)30 min，供GC-MS/MS法定量檢測(cè)或確證。

1.4 質(zhì)譜條件

1.4.1 儀器參考條件

a)色譜柱：5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm（i.d.）×0.25 μm，或相當(dāng)者；

b) 流速：1.0 mL/min；

c) 程序升溫：75℃保持1 min，以30℃/min速率升溫至220℃，再以5℃/min速率升溫至250℃，保持2 min；

d）進(jìn)樣口溫度：250℃；

e） 接口溫度：280℃；

f）進(jìn)樣量：1 μL；

g）進(jìn)樣方式：不分流方式，溶劑延遲4.5 min；

h）電離方式：電子轟擊電離（EI）；

i）電離能量：70 eV；

j）離子源溫度：230℃；

k）四級(jí)桿溫度：150℃；

l）碰撞氣流速：高純氮?dú)?.5 mL/min；

m）碰撞能量：10 eV；

n） 掃描方式：采用多反應(yīng)檢測(cè)（MRM），定量離子m/z342＞327，定性離子m/z342＞327，342＞171。

1.5 測(cè)定

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/mL），0mL、0.04 mL、0.08 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL分別于7個(gè)100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。各取1 mL用氮?dú)獯蹈桑?.3.3步驟衍生化。配制成衍生產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.0μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.075μg/mL、0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。反應(yīng)液供GC-MS/MS測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5.2 定量測(cè)定

待測(cè)樣液中三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)的響應(yīng)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)對(duì)凈化液稀釋，重新衍生化后再進(jìn)樣分析。

1.5.3 定性判定

以標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間以及多反應(yīng)檢測(cè)離子（m/z 342＞327、342＞171） 定性；樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過表1的規(guī)定，則可判斷樣品中存在三聚氰胺。

表1 定性離子相對(duì)豐度的最大允許偏差

1.6 結(jié)果計(jì)算

試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或

式中：X—試樣中三聚氰胺的含量，mg/kg；

A—試樣中三聚氰胺的峰面積；

c—標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V—樣液最終定容體積，mL；

As—標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積；

m—試樣的質(zhì)量，g；

f—稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

由于氣相-質(zhì)譜/質(zhì)譜法具有分析速度快、檢測(cè)靈敏度高和應(yīng)用范圍廣泛的特點(diǎn)，本試驗(yàn)選用了氣相-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀器，儀器條件選擇主要參照了GB/T22388-2008《乳及乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)方法》中氣相-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GC-MS/MS） 的儀器條件，結(jié)合實(shí)驗(yàn)儀器的特點(diǎn)調(diào)整了碰撞能量、碰撞氣流速、接口溫度。

2.2 樣品前處理方法的選擇

三聚氰胺具有溶于熱水，微溶于冷水，極微溶于熱乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等特性；結(jié)合乳制品中三聚氰胺提取和凈化的前處理方法，優(yōu)化本課題中5類產(chǎn)品中三聚氰胺的提取和凈化方法，選擇了乙腈或甲醇超聲提取（動(dòng)物油脂需先使用三氯甲烷溶解，再用甲醇超聲提取），提取液離心過濾凈化。

2.2.1 水產(chǎn)制品

準(zhǔn)確稱取混勻試樣1 g（精確到0.01 g），加入10.00 mL乙腈水或甲醇水，渦旋混勻2 min后超聲提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min離心10 min，取上清液用直徑0.2 μm微孔濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取200 μL濾液，50℃下氮?dú)獯蹈桑苌蠊〨C-MS/MS法定量檢測(cè)或確證。對(duì)蝦米、熏魚片、鹽制魚等水產(chǎn)制品中三聚氰胺進(jìn)行了加標(biāo)檢測(cè)，回收率達(dá)90%以上，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，RSD＜5.0%。

2.2.2 水產(chǎn)品

準(zhǔn)確稱取混勻試樣1 g（精確到0.01 g，試樣取可食部分切碎混勻），加入10.0 mL乙腈或甲醇，渦旋混勻2min后超聲提取15min，于4℃以4000r/min離心10 min，取上清液200 μL用直徑0.2 μm有機(jī)濾膜過濾，氮?dú)獯蹈桑苌蠊〨C-MS/MS法定量檢測(cè)或確證。對(duì)鮮魚、凍蝦、鮮蟹、鮮貝等水產(chǎn)品中三聚氰胺進(jìn)行了加標(biāo)檢測(cè)，回收率達(dá)90%以上，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，RSD＜5.0%。

2.2.3 衍生化

取上述氮?dú)獯蹈蓺埩粑铮尤?00 μL吡啶和200 μL衍生化試劑混勻，70℃反應(yīng)30 min，供GC-MS/MS法定量檢測(cè)或確證。

2.3 線性范圍的確定

確定標(biāo)準(zhǔn)系列的范圍，選用從0.005 μg/mL至0.1 μg/mL，6個(gè)不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果從標(biāo)準(zhǔn)系列來看，線性關(guān)系良好，R2=0.999 4。見圖1、圖2、圖3。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 三聚氰胺衍生物GC-MS/MS選擇離子質(zhì)譜圖

圖3 三聚氰胺衍生物GC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)量質(zhì)譜圖

2.4 檢出限的確定

在本試驗(yàn)條件下，將標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)稀釋后進(jìn)行干蝦米、烤魚片、鮮魚、鮮蝦、鮮蟹、鮮貝、空白樣品的加標(biāo)回收，根據(jù)3倍噪音的峰響應(yīng)值和10倍噪音的峰響應(yīng)值、取樣量和進(jìn)樣量，得出該方法檢出限為0.01 mg/kg，該方法定量限為0.03 mg/kg。

2.5 精密度的測(cè)定

對(duì)蝦米、熏魚片、鮮魚、凍蝦、鮮蟹、鮮貝等樣品前處理采用了乙腈超聲提取法和甲醇超聲提取法兩種方法，分別按已確定的儀器方法對(duì)三聚氰胺進(jìn)行6次測(cè)定（對(duì)不同樣品加不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜5.0%。

2.6 回收率的測(cè)定

取蝦米、熏魚片、鹽制魚、鮮魚、凍蝦、鮮蟹、鮮貝等樣品使用乙腈超聲提取和甲醇超聲提取，分別離心凈化，氮?dú)獯蹈桑苌蟀匆汛_定的質(zhì)譜條件加不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，回收率均＞90.0%。

3 結(jié)語

通過大量試驗(yàn)證明，用上述方法可以對(duì)水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品食品中三聚氰胺進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 4，線性關(guān)系良好；方法回收率達(dá)90%以上；RSD＜5.0%，精密度高。

［1］宋書鋒，魯杰，安娟，等.GB/T22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法〔S〕.中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［2］李紅梅，張慶合，湯樺，等.GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速檢測(cè)液相色譜法〔S〕.中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

Research on the detection methods of melamine content in fishery products and aquatic products

LIANGBao-ai*ZHANGSu-juan
（National farmproducts and liquor qualitysupervision and inspection center,Shanxi Province foodstuffqualitysupervision and inspection center，Taiyuan 030012，China）

The melamine contents in fresh,cool or frozen fishery products（farming-fish,shrimp,crab,cowry and so on）and aquatic products(dried,smoke-dried,saline)were detected by gas chromatography-mass/mass spectrometry (GC-MS/MS).Samples were extracted with acetonitrile and methanol，extracting solution was purged after decentralization，blowed dry through nitrogen and derivatized with a mixed system composed of BSTFA and TMCS （99:1，V/V）prior to GC-QqQ-MS/MS analysis in multiple reaction monitoring（MRM）mode.The optimal values of crucial instrument parameters and matrixinterference were investigated.Melamine was qualified using the ion pairs of m/z 345＞171 and m/z 342＞327 and quantified using the ion pair of m/z 342＞327.The developed method exhibited good linearitywithin the range of0.0050 to0.100 ug/L.The regression equation was y=1 434 164.378 8x-704.012 5，and correlation was 0.999 4.The detection Limit was 0.03 mg/kg for melamine(RSN=10)and the recoveries for determining melamine were greater than 90%.The relative standard deviations were less than 5.0%.This method is simple and convenient,rapid,sensitive and accurate，and can meet analysis requirements ofmelamine in fisheryProducts and aquatic products.

fishery products and aquatic products；melamine； detection； gas chromatography-mass/mass spectrometrymethod

*梁寶愛，女，1963年出生，1983年畢業(yè)于太原理工大學(xué)化學(xué)分析專業(yè)，高級(jí)工程師。

2010-11-04