乳品中有害微生物的檢測技術和發展方向

張守文，尹蕾，周玉玲

（1.黑龍江省食品藥品監督管理局，哈爾濱 150020；2.哈爾濱商業大學食品學院，哈爾濱 150076）

乳品中有害微生物的檢測技術和發展方向

張守文1，尹蕾2，周玉玲2

（1.黑龍江省食品藥品監督管理局，哈爾濱 150020；2.哈爾濱商業大學食品學院，哈爾濱 150076）

從食品安全的角度出發，系統地介紹了乳品中主要高危害致病菌及其危害、檢測方法的歷史進程、當前國內外乳中有害微生物的檢測方法、乳中微生物檢測技術的發展方向。

乳品，微生物，檢測技術，發展方向

0 引 言

近年來，乳品安全事件頻繁發生，其中大部分是由于污染致病菌引起的大規模乳品中毒事件。2008年，珠海、江門兩市多家幼兒園發生飲用乳制品中毒事件[1]，后經調查該批牛奶中含有大量金黃色葡萄球菌。這一事件再次使乳品安全問題成為社會各界關注的焦點。

乳以安為重。有害菌的快速檢驗和有效鑒定對乳品的質量和安全有著重要意義。目前，常規的乳品檢測手段有微生物法、理化法和免疫法等，隨著分子生物學技術的發展，PCR技術、基因芯片、流式細胞技術等技術也被用于乳品中微生物的檢測鑒定。本文綜述了乳品中有害致病菌的檢測技術及其發展動態和趨勢。

1 乳中主要有害微生物及其危害

乳品中常見病原菌檢測品種有：沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、小腸結腸炎耶爾森式菌、單增李斯特氏菌、大腸桿菌、耶爾森氏菌、空腸彎曲菌等，包括阪崎腸桿菌。這些致病菌可引起人類劇烈嘔吐、腹瀉、虛脫、急性胃腸炎等，甚至危及生命。2002年，美國FDA在某一國際乳業巨頭公司生產的嬰幼兒配方奶粉中新檢出了一種致病菌——阪崎腸桿菌，可以引發嬰兒、尤其早產兒腦膜炎、敗血癥及壞死性結腸炎散發和爆發，由阪崎腸桿菌引發疾病而導致的死亡率可達40%～80%。2003年又一家國際公司主動召回了一批檢出極微量阪崎腸桿菌的罐裝早產兒特殊配方奶粉，阪崎腸桿菌從此成為世界乳業矚目的焦點。2008年，我國國家質檢總局公布了味全奶粉、澳優乳品均被檢驗出含有致病菌阪崎腸桿菌。聯合國糧農組織和世界衛生組織經過風險性評估，將阪崎腸桿菌和沙門氏菌共同列為嬰幼兒配方奶粉A類致病菌。

2 檢測方法的歷史進程

通常檢測食物病原體有多種方法，17世紀中葉荷蘭人呂文虎克用自制的簡單顯微鏡觀察并發現了許多微生物。Widal[2]于1896年利用傷寒病人血清與傷寒桿菌發生特異性凝集的現象成功地診斷傷寒病，這便是免疫學方法的初步運用。18世紀，體液酶的分析通過堿性磷酸酶檢測肝功能；血清淀粉酶檢測胰腺炎；酶類標志物檢測心臟病；19世紀，放射及酶聯免疫分析激素檢測內分泌功能；腫瘤標志物檢測癌癥；蛋白標志物檢測心臟病；到了20世紀，生化檢測方法檢測糖尿病、心血管病等；21世紀，應用分子生物學，通過實時定量PCR分子診斷儀實現基因診斷食品安全、病原體及傳染、腫瘤、遺傳病等。

3 乳中有害微生物檢測方法

不論是用于生產、零售還是未指明用途的乳和乳制品，絕大多數國家對沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、彎曲桿菌、產氣夾膜梭菌以及大腸桿菌5467均要求不得檢出，而大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的檢測則有不同的限量標準[3]。

3.1 微生物學檢測方法

傳統的微生物學檢測方法有標準平板計數法（SPC）和顯微鏡直接觀察法（DMC），是最普通的活菌總數測定法，也是絕大多數企業和質檢部門最常用的兩種方法。傳統的微生物學檢測方法具有所需設備簡單，成本相對較低的優點，但其操作繁瑣，檢測周期長，且靈敏度較低，并且對于有些細菌無法給出正確鑒定[4]。皿膜系統與即用膠系統法、疏水網格濾膜法、螺旋板系統均是學者們對這兩種方法在提高操作效率和細胞計數方面的改進。疏水網格濾膜法優點是濃縮靶細菌,去除樣品中的抑制因子,轉移過程不需要再懸浮以免使菌體遭受物理破壞。濾膜法被廣泛應用于生乳、巴士殺菌乳的質量管理中。

此外，為了克服人工計數的緩慢與疲勞，許多學者發明了全自動菌落計數系統，如英國Bibby SC5菌落計數器，Spiral Biotech公司的CASBATM，Celsis公司的Scan500及Synopitics公司的全自動菌落計數器，均可快速、準確地計數。

3.2 生物電化學方法

生物電化學方法[5]是指通過電極測定生物量產生或消耗的電荷提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位等會發生相應變化，所以可通過分析這些電化學參量的變化，實現對微生物的快速測定。在牛奶的檢測中常見的有還原試驗法；電導、阻抗法；生物傳感器法。還原試驗法避免了色素的生色靈敏度低、不能迅速測量的缺點。有的學者使用電阻抗技術快速檢測牛奶中的大腸菌群。電導、阻抗法的缺點是必須先做出標準曲線，需要時間長。應用于乳品檢測的此類產品主要有英國的MALTHUS微生物分析儀和法國的Bactometer微生物監測儀等。

3.3 免疫學檢測方法

免疫檢測的基本原理是抗原抗體反應。不同的微生物有其特異的抗原，并能激發機體產生相應的特異性抗體。在免疫檢測中，可利用單克隆抗體檢測微生物的特異抗原，也可利用微生物抗原檢測體內產生的特異抗體，兩種方法均能判斷機體的感染狀況。運用于乳中致病菌的免疫學方法主要有免疫磁性分離技術、酶聯免疫吸附技術（ELISA）、酶聯熒光免疫吸附技術（VIDAS）等。各種免疫學方法的基本過程是相同的，先要進行病原菌的富集培養，再對富集物進行免疫檢測和分析。前者需18～24h，甚至更長時間，而免疫檢測過程則僅需幾小時，甚至幾分鐘。因此可以采用免疫磁珠分離方法或免疫膜富集技術等減少樣品的富集時間。當然，免疫學方法也有許多需要改進的方面，主要包括交叉反應、假陽性多、靈敏度偏低。在英國，免疫磁性分離技術主要應用于牛奶中大腸桿菌O157：H7的[6]監測。而Tsai等[7]用ELISA對奶酪和酸牛奶中的雜色曲霉、多主枝孢、白地霉、卷枝毛霉和產黃青霉進行了檢測。

3.4 分子生物學方法

3.4.1 PCR技術

PCR是一種在體外快速擴增特異目標基因的技術。它可以在試管中建立反應，獲得足夠數量的DNA拷貝。PCR歷史發展為3個階段：定性PCR（電泳法）、酶免法定量PCR、實時熒光定量PCR。定性PCR具有快速、靈敏、特異等優點，可以克服傳統檢測方法的缺點和不足。但過程比較復雜；不能區分有活性和沒有活性的細菌；使用的染色劑溴化乙啶是致癌物質，可能危及操作人員的健康。實時熒光定量PCR技術比定性PCR技術發明晚將近10年，相比定性PCR，它有如下突出優點：熒光定量PCR反應過程實時監測、熒光定量重復性好、基因定量分析——穩定性好、熒光檢測——濃度梯度試驗線性范圍寬、熒光定量在對數期進行定量分析等優勢。實時熒光定量PCR技術采用國際通行的檢測標準進行乳品中阪崎腸桿菌的檢測。

2005年5月20日，由中國檢驗檢疫科學研究院和天津出入境檢驗檢疫局牽頭完成的《奶粉中阪崎腸桿菌檢測方法》行業標準通過審定。這項標準的出臺，解決了我國檢測嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌無標準、無檢測方法的問題。另外，多部國家標準明確要求用PCR方法檢測阪崎腸桿菌、食品中致病菌等。如《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準》SN/T1632.1—2005奶粉中阪崎腸桿菌檢驗方法；2006年國家出臺的《嬰幼兒配方乳粉生產許可證審查細則》中明確要求采用國際通行的“熒光PCR儀”作為出廠檢驗必備設備，此要求已成為乳品企業生產許可證核發的必要條件。

在學術研究方面，胡建華[8]等采用快速常規PCR和定量實時PCR相結合，對培養液中及牛奶陽性樣品中的志賀氏菌進行檢測，檢測敏感度可達到2 mL-1，檢出時間小于20 h。新建的PCR方法適用于快速、準確檢測牛奶中志賀氏菌的需要，具有較高的實用和推廠價值。呂艷[9]等人利用PCR技術可在5 h內檢測牛奶中的金黃色葡萄球菌，最低檢出限度35 ng/μL。趙寧[10]等人采用過濾富集菌體后PCR技術來檢測原料乳中蠟樣芽胞桿菌。馬冬[11]等人利用PCR技術檢測的是乳品中大腸桿菌。總體來說，PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、抗污染能力強（熒光PCR）、容易操作等特點（見表1）[12]。但PCR方法容易受到乳品成分（如蛋白）的干擾，抑制PCR反應的順利進行。所以，乳品樣本的前期處理及富集增菌技術還需進一步的研究。

表13 種檢測方法的比較

3.4.2 ATP生物熒光技術

ATP生物熒光技術的原理[13]是ATP分子能量通過熒光酶復合物的作用轉變為光，熒光強度與ATP濃度在一定范圍內呈線性相關，而ATP在生物活細胞內的含量大致恒定，以此可推測被檢樣品中微生物數量。ATP生物熒光技術檢測乳制品中的細菌總數及特異性病原菌具有簡便、快速、靈敏等特點，在原料奶的驗收、乳制品貨架期預測及抗生素、細菌、噬菌體殘留的檢出等方面應用前景廣闊。Samkutty等利用線性回歸方程和ATP值預測了原料乳中的菌落總數[14]。在衛生監測中，ATP生物熒光技術5 min即可檢出結果，其數據與平板計數法的結果相關性大于80%。

3.4.3 液相芯片技術

液相芯片技術 （MASA）是一種全新微量分析技術。其原理是將流式細胞術與熒光標記檢測相結合，把針對不同目標分子的探針與不同熒光值的微球共價偶聯，然后使其與目標分子在懸液中特異性結合，通過熒光信號特異性檢測到目標分子[15]。其特點是高靈敏性、高準確度、重現性好、高通量多指標同步分析，對單孔內多達100種不同的反應同時進行檢測。其缺點是檢測成本昂貴，達不到低成本檢測的目的。陳昱[16]等人運用建立的液相芯片檢測體系對牛奶中志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157進行了檢測。液相芯片技術檢測致病細菌，綜合了PCR和核酸雜交的優點，無需培養直接分析，在微生物定性檢測以及基因分型等方面獨具優勢。

3.5 分析化學技術

隨著分析化學技術的日新月異,很多儀器分析手段和方法如高效液相色譜[17]（HPLC）、氣相色譜（GC）、氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用（LC-MS/MS）等，已顯示出了在微生物檢測中的潛力。這些方法不同于依賴微生物生物學特征的檢測方法，而是通過分析微生物的化學組成（生物標志物）來區分和鑒定微生物，開辟了檢測和鑒定微生物的新途徑。但在乳品有害微生物檢測中的應用較少。

4 乳品中微生物檢測的發展方向

綜上所述，乳中微生物的檢測方法多種多樣，各有優缺點，可以采用多種方法聯合使用的策略來提高檢測靈敏度和檢測效率。但是，乳品從源頭到消費者飲用經歷原料驗收、運輸、生產、包裝、銷售等環節，任何環節都存在污染的風險，確保全程實時檢測是乳品微生物檢測接下來的發展方向。

4.1 在線檢測

目前，在線檢測成為乳品中致病菌檢測的發展趨勢。在國外，超聲波技術、生物傳感器[5]和高效毛細管電泳分析技術已被應用于乳品檢測及在線檢測[18]，這些方法具有測量快速、操作簡單和信號可控性等實時檢測特點。黃曲霉毒素的去毒及在線檢測技術是一項牛奶加工的關鍵技術，具有巨大的市場潛力和重大的社會效益，特別是牛奶中AFT的去除技術是國際上牛奶加工尚未完全攻克的技術。該技術產品具有國際競爭力。采用先進的生物工程技術利用生物酶研制AFT反應器、生物傳感器和“自生”式免疫親和柱等系列產品，用于AFT的去毒和分析檢測。“自生”式免疫親和柱是國際上牛奶加工需要的關鍵技術。中國乳品致病菌的在線檢測技術與設備仍處在初級階段，多數企業還在采用傳統的檢測方法。在線新技術的研發和應用將是我國乳品中致病菌檢測方法的未來發展趨勢。隨著科學技術和各個學科的交叉發展，在線檢測最終將徹底改變乳中致病菌檢測的現狀和傳統的觀念，實現高效、優質、廉價的統一。

4.2 現場檢測

隨著社會的發展和人們生活水平的提高，食品檢測現場化、家庭化的呼聲越來越高。相應地，對食品檢測儀器的小型化、智能化、集成化、便攜式的要求也越來越迫切。這些儀器的研制和生產，是今后乳品中微生物檢測技術的另一發展趨勢。當前，學者們提出的構建生物芯片及縮微芯片理念，將進一步面向現場和速測方面。

縮微芯片實驗是在一個芯片上包含了分析所具備的一切重要部分：樣品處理、反應試劑、檢測器等。一些所謂芯片實驗室的技術已經市場化，如基因芯片。芯片技術將越來越多地進入乳品類食品病原菌檢測技術領域，實現檢測系統的集成化、一體化。我國國家生物芯片中心等單位已開發并生產食源性致病菌檢測、食源性病毒檢測和獸藥殘留檢測的生物芯片技術平臺（儀器和試劑盒），未來的檢測儀器與計算機緊密結合，自動采集數據、處理數據，更科學、更準確地提供結果，實現采樣、進樣、結果一條龍，形成檢測的自動化系統。

將納米技術與生物傳感器技術相結合，檢測乳品中致病菌的方法在國外已有相關報道，而我國還未涉及。納米結構通常是指尺寸在100 nm以下的微小結構。像一個單一細胞膜一樣的納米傳感器將具有其他傳感器無法比擬的靈敏度和快速的響應時間。生物傳感器的納米化，可使人們在市場上直接檢測食品成為可能[19]。

近年來發展迅速的電子鼻和電子舌等仿生技術和傳感器技術[20,21]，能夠快速反應出被測樣品的整體特征信息，在乳制品品質及貨架期監控等方面的應用研究異常活躍。目前，電子鼻在微生物方面的檢測針對不同的腐敗菌種類及其生長規律進行研究。針對高危險致病性微生物的檢測還有待于研究。

4.3 低成本檢測

現代檢測技術存在共性的問題：檢測成本高。昂貴的檢測儀器及試劑并不符合我國檢測行業的標準，也不符合我國國情，尤其是對基層食品檢測工作。我國農村人口高達9億，農村市場是乳品消費的一大主力。所以，農村市場的乳品檢測監測勢在必行。而昂貴的檢測成本對于基層食品檢測負擔太大，阻礙檢測工作的進行。而且，檢測技術的不斷進步，必然要求不斷降低產品成本，提高靈敏度、穩定性和延長壽命。這些特性的改善也會加速檢測儀器現場化、商品化的進程。

5 結束語

乳品安全是一個重大的公共衛生問題。研究和應用先進的安全檢測技術，可有效監控乳品中的危險因素，預防和控制食源性疾病的發生。乳品中各類微生物檢測方法各自表現出不同的優缺點[22]：如傳統的增殖培養、生化試驗等方法，鑒定過程時間長；免疫學方法快速、靈敏度高，但容易出現假陽性、假陰性；VIDAS等雖然快速準確、通量大，但只能鑒定到屬，僅適用于初篩，而且費用頗高。基因芯片、蛋白質芯片準確、通量大，但制作費用太高，并且菌種的選擇性富集培養仍屬研究重點[23]，不利于普及。

建立更靈敏、更有效、更可靠、更簡便的微生物檢測技術是保證乳品安全的迫切需求和乳品微生物檢測技術的發展趨勢。生物技術是21世紀最具活力的技術，隨著分子生物學各種檢測方法之間交叉發展、相互融合、聯合使用，必將為我國乳品生產構建起一道有效的安全屏障。多種檢測技術以及各學科的交叉發展有望能解決上述需求。

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Introduction and the development direction on the detection technique of harmful micro-organisms in dairy products

ZHANG Shou-wen1，YIN Lei2，ZHOU Yu-ling2
（1.Heilongjiang Food and Drug Administration，Harbin 150020,China）
（2.College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076,China）

This paper,in terms of food safety,systematically reviews disadvantage of main high-hazard pathogens in dairy products and the historical process of the detection method,the detection technique of harmful micro-organisms in milk on current domestic and international,the direction of development of microbial detection techniques in milk.

dairy products；micro-organisms；detection technology；the development direction

TS252.1

B

1001-2230（2010）01-0035-04

2009-09-30

張守文（1956-），男，教授，主要從事食品科學，工程和食品安全管理方面的研究。