凝膠色譜法測(cè)定保健食品中免疫球蛋白IgG

宋戈，郝巖平，姜金斗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱 150086）

凝膠色譜法測(cè)定保健食品中免疫球蛋白IgG

宋戈，郝巖平，姜金斗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，哈爾濱 150086）

建立了凝膠色譜法測(cè)定保健食品中免疫球蛋白IgG含量的方法。采用紫外檢測(cè)器，測(cè)定波長(zhǎng)280 nm；色譜柱為ZorbaxGF-250，柱溫為20℃，流動(dòng)相為0.01 mol/L KH2PO4+0.1 mol/L K2HPO4+0.15 mol/LNa2SO4（pH 6.0）,流速為1.0 ml/min；樣品調(diào)pH值為4.6沉淀酪蛋白及變性乳清蛋白后過濾分離。本方法的最低檢測(cè)限為1 mg/g，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9999，回收率在97.2%～103.2%，RSD為1.38%。

凝膠色譜；免疫球蛋白；保健食品

0 引 言

近年來(lái),對(duì)富含IgG的牛初乳用做食品的添加劑的研究成為熱點(diǎn)。將IgG添加到嬰幼兒配方奶粉、保健食品中,對(duì)于改善嬰幼兒、中老年人及免疫力低下的人群的健康有重要意義。因此，需要建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)保健食品中IgG的方法。常用的測(cè)定牛初乳制品中IgG的方法有瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法[1]、酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法[2]、化學(xué)發(fā)光自顯影法[3]和毛細(xì)管電泳法[4]等。這些方法操作復(fù)雜、重復(fù)性差且耗時(shí)，成本高。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[5]采用的是高效親和色譜法，該法分析時(shí)間較長(zhǎng),而且不適用于大量常規(guī)樣品的測(cè)定。而目前高效液相色譜法[6，7]達(dá)不到測(cè)定的分離要求，有待進(jìn)一步不完善。

本文對(duì)凝膠色譜法測(cè)定免疫球蛋白IgG進(jìn)行了研究,建立了測(cè)定保健食品中免疫球蛋白IgG的方法，并通過對(duì)市售的保健食品樣品中的免疫球蛋白IgG的檢測(cè)論證該方法的可行性。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器設(shè)備

Waters 1525高效液相色譜儀，Waters 2487紫外檢測(cè)器，酸度計(jì)，磁力攪拌器。

1.2 試劑

磷酸氫二鉀，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，氯化鈉、硫酸鈉、磷酸等均為分析純 （AR.）；IgG標(biāo)準(zhǔn)品（≥95%）；含IgG片劑、粉劑、膠囊及牛初乳。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax GF-250柱，4 μm×9.4 mm×250 mm，柱溫20℃，測(cè)定波長(zhǎng)280 nm，流動(dòng)相為0.01 mol/L KH2PO4+0.1 mol/L K2HPO4+0.15 mol/L Na2SO4（pH=6.0）[8],流速為1.0 mL/min。

1.3.2 樣品處理

液體樣品直接吸取20 mL移入150 mL三角瓶中稱量；固體樣品應(yīng)先研碎 （不能用粉碎機(jī)粉碎）稱量0.5000 g移入三角瓶中，加入40℃左右水20 mL，用磁力攪拌器攪拌溶解樣品。用酸度計(jì)精確調(diào)pH值至4.6后，將樣品洗入漏斗中過濾，用50 mL容量瓶收集濾液，用蒸餾水定容，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾,供分析測(cè)定。

1.3.3 定量測(cè)定

標(biāo)樣與樣品測(cè)定的疊加色譜如圖1所示。

圖1 標(biāo)樣與樣品測(cè)定的疊加色譜

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

通過對(duì)不同流動(dòng)相的試驗(yàn)研究，在滿足分離效果，達(dá)到待測(cè)組分與雜質(zhì)基本分離的條件下，選擇了能改善待測(cè)組分響應(yīng)，提高靈敏度的流動(dòng)相。

2.2 樣品的處理

由于免疫球蛋白受熱后極易變性，在74℃（15 s）就遭到破壞，從而失去活性，所以溶解固體樣品的水不能超過74℃。由于粉碎機(jī)粉碎樣品是會(huì)產(chǎn)生高溫，能導(dǎo)致免疫球蛋白變性，所以用研缽將樣品研碎。經(jīng)過比對(duì)試驗(yàn)，將樣品溶液的pH調(diào)至4.6除出酪蛋白及變性乳清蛋白后，不影響所測(cè)得的結(jié)果，為了進(jìn)一步除出雜質(zhì)和延長(zhǎng)色譜柱的壽命，所以對(duì)樣品溶液進(jìn)行了調(diào)pH。片劑、粉劑及膠囊等保健食品中脂肪含量很少，即使是牛初乳，經(jīng)過調(diào)pH值除蛋白，紙過濾后，殘留的脂肪很少，不會(huì)影響免疫球蛋白測(cè)定，從而不用高速離心除出脂肪，就能分析測(cè)定，可以大大提高工作效率。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性相關(guān)系數(shù)

分別配置不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，依次進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果如表1所示；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果如圖2所示，其相關(guān)系數(shù)為r=0.9999。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

以同一個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)材料，加入質(zhì)量濃度為1g/L的IgG標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL,然后進(jìn)行樣品處理，分析測(cè)定，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，回收率在97.2%～103.2%之間。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一個(gè)樣品，進(jìn)行了7次檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性較好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%，測(cè)定結(jié)果較為穩(wěn)定。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)g/100g

2.6 檢出限

取標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，以3倍的基線噪聲為峰高計(jì)算。本方法的檢出限為1 mg/g，完全滿足保健食品中免疫球蛋白IgG測(cè)定。

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

分別對(duì)含有IgG的（片劑、粉劑及膠囊）保健品樣品進(jìn)行了檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果如表4所示,測(cè)量值與產(chǎn)品標(biāo)示值基本吻合。

表4 保健食品中免疫球蛋白IgG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果g/100g

3 結(jié) 論

本文確定了提高檢測(cè)免疫球蛋白IgG靈敏度的流動(dòng)相，重點(diǎn)研究了樣品處理免疫球蛋白IgG測(cè)定的影響，建立了凝膠色譜法測(cè)定保健食品中免疫球蛋白IgG的方法，該方法測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，簡(jiǎn)單易操作，是測(cè)定保健食品中免疫球蛋白IgG較好的方法。

[1]吳繼堯,劉鵬龍,張丹鳳，等.瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定牛初乳中IgG[J].新疆農(nóng)業(yè)科技,2001,38（5）：252-254.

[2]項(xiàng)新華,尹香君,趙丹慧，等.酶聯(lián)免疫雙抗體夾心法檢測(cè)牛初乳素中免疫球蛋白IgG[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2002,12（2）：137-138.

[3]劉翼瓏,喬惠理,鄧澤沛.測(cè)定牛IgG的化學(xué)發(fā)光自顯影法的建立[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,1998，258（1）：187.

[4]王茜,丁曉靜,王心宇，等.毛細(xì)管電泳法快速測(cè)定保健食品中免疫球蛋白G[J].分析化學(xué),2006,34（8）：1161-1164.

[5]GB/T5009,194-2003保健食品中免疫球蛋白IgG的測(cè)定[M].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[6]馬燕芬,陳志偉,魏曉兵，等.高效液相色譜法測(cè)定牛初乳中IgG含量的方法研究[J].飼料工業(yè),2007,28（5）：33-38.

[7]熊勇華,許楊,魏華，等.HPLC法檢測(cè)牛初乳中IgG含量[J].食品工業(yè)科學(xué),2003（9）：80-82.

[8]Dried Milk Assessment of Heat Treatment Intensity High Performance Liquid Chromatographic Method[S].IDF Standard，1992：162.

Determination method of IgG in health foods by GFC

SONG Ge，HAO Yan-pin，JIANG Jin-dou
（Northeast Agriculture University National Dairy Testing Center,Harbin 150086,China）

A method for determination of IgG in dairy by GFC is reported.ultraviolet detector,testing wavelength 280nm,GF-250 column was used with column temperature 20℃.Mobile phase 0.01mol/L KH2PO4+0.1 mol/L K2HPO4+0.15mol/L Na2SO4（pH 6.0）.The speed of mobile phase was 1.0ml/min.Sample deposit casein and metamorphic whey by pH 4.6.The minimum detectable value was 1mg/g.The relative coefficient was 0.9999.The recovery ranged from 97.2%～103.2%.The relative standard deviations（RSD）was 1.38%.

GFC；IgG；health foods

TS252.7

A

1001-2230（2010）01-0055-02

2009-07-17

宋戈（1982-），男，助理工程師，從事乳制品檢測(cè)與研究。