宣威肺癌高發區室內PM10對肺泡上皮細胞凋亡的影響

周 林,邵龍義,劉君霞,宋曉焱 (中國礦業大學(北京)地球科學與測繪工程學院,煤炭資源與安全開采國家重點實驗室,北京 100083)

云南省宣威地區農村的肺癌發病率居全國之首,其中尤以女性肺癌發病率高,在世界女性肺癌死亡率水平中亦屬前列[1-2].目前,國內外學者對宣威肺癌高發原因及影響因素進行了一系列的研究,發現宣威農村肺癌的高發病率與家庭使用煙煤高度相關;吸煙并不能解釋宣威肺癌特殊的流行病學特征,吸煙者肺癌發病率和死亡率在肺癌高發區和地發區、男女之間的差異無統計學意義;以煙煤和木柴為生活燃料的家庭室內可吸入顆粒物濃度高,宣威肺癌高發地區長期燃燒煤煙造成室內以苯并芘(Bap)為主的多環芳烴類物(PAH)污染是宣威肺癌高發的主要原因之一;基因檢測研究表明,宣威肺癌患者中存在肺癌易感基因;宣威肺癌的產生可能與所使用的煙煤及其產物中所含的微纖維狀石英有關[3-11].

肺泡上皮細胞(AEC)是顆粒物接觸和沉積的最初靶細胞,是肺組織最有可能受到顆粒物的毒性損害的細胞,同時AEC在肺癌的發生中具有重要的作用[12].目前宣威肺癌的研究尚未有直接針對肺泡上皮細胞的研究,尤其是 PM10對肺泡上皮細胞的毒性損害研究,對于進一步研究肺癌發病機制具有重要意義.

本研究通過肺上皮細胞 A549建立PM10體外染毒模型,應用Annexin V/PI雙染色FCM研究宣威肺癌高發地區室內PM10對人肺泡上皮細胞A549的凋亡的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

硫酸亞鐵 D MEM 培 養液(Gibco,USA),胎牛血清(天津TBD公司),青鏈霉素(Invitrogen, USA),胰蛋白酶(Amresco,USA),臺盼藍(Sigma分裝,USA), 四甲基偶氮銼藍(MTT Amresco, USA),AnnexinV-FITC/PI試劑盒(北京寶賽公司),二甲基亞砜(DMSO Amresco,USA)等.實驗所用的人肺泡上皮細胞由北京大學醫學部提供.用含 l0%的胎牛血清和青鏈霉素雙抗 DMEM 養液,37℃,5%CO2,飽和濕度條件下培養,細胞融合80%時,分別用0.5%和0.25%的胰蛋白酶消化,傳代用于實驗.

1.2 采樣地點

采樣地點之一的肺癌高發區虎頭村位宣威市近郊的來賓鎮,海拔 1859.8m,位于虎頭山的北坡,背南風,空氣不流通,主導風向為西南風,附近有長征煤礦、燕塘煤礦等 5家較大的煤礦,以品質較低的煙煤為主.虎頭村村委會下轄 9個自然村,約4000多人,2007年有20多人死于肺癌,其中虎頭村最為嚴重,約10人左右死于肺癌.在虎頭村隨機選取3戶有肺癌患者家庭采樣,這3戶人家主要生活燃料是來自于附近煤礦的煙煤,日常做飯、取暖均使用采用開放式“火塘”,“火塘”沒有煙囪和爐橋,上口與地面平行.由于缺乏通風裝置,室內煙塵濃度很高,在一些家庭堂屋內監測到總懸浮顆粒物濃度可達20mg/m3.

作為對照的采樣點位于西澤鄉寧家灣村,屬于肺癌低發區域,距離宣威市區 30km左右,附近無煤礦及其他污染企業,村民生活燃料普遍以木柴為主,少量使用無煙煤,采樣家庭有獨立廚房,有通向室外的煙囪.寧家灣村民呼吸系統疾病患病率低,2000年以來無肺癌患者.

1.3 樣品的采集及處理

采樣時間為2008年12月25日～2009年1月28日.其中虎頭村采樣22d,寧家灣村采樣7d.采樣儀器:KB80-E型采樣泵(青島嶗山電子),粒度切割器(Negretti,UK)以及孔徑為0.67μm,直徑為47mm 的聚碳酸酯濾膜(Millipore,USA).在客廳距地面 120cm放置采樣儀.采樣流量為30L/min,12h連續采集室內 PM10樣品,同時記錄采樣點溫度、氣壓、濕度、室內生活狀況等要素.溫度和濕度由溫度/濕度監測器(Oregon Scientific,UK)測得.采集部分樣品用于細胞染毒試驗.試驗樣品參數如表1所示.

表1 實驗樣品參數Table 1 Parameters of samples

將樣品干燥,用干凈消毒的手術剪稱重后的濾膜剪碎,置于15mL的潔凈離心管中,加入5mL HPLC級水(Fisher化學公司,UK),封口膜封口,放在渦旋振蕩器(Scientific Indus-tries,Vortex Genie 2)上輕輕振蕩6h,然后移出溶液,在濾膜中重新加入5mL HPLC級水,再一次振蕩6h,使顆粒物盡可能地從濾膜上分離開來,并將 2次振蕩的溶液移到一個離心管中;取出濾膜,在通風櫥內自然冷干后稱重,通過差減法得到振蕩下來的顆粒物的量;加入適量的HPLC級水顆粒物配成溶液,部分液體置于1.5mL的離心管中,在渦旋振蕩器上輕輕振蕩16h后,再超聲振蕩2min,以使樣品中的水溶部分充分溶解后即為顆粒物水溶液,4℃保存備用.分別配制成 0,25,50, 100,200μg/mL 5 個濃度的全樣溶液進行肺泡上皮細胞染毒試驗.

1.4 細胞凋亡試驗

從液氮罐中取出凍存的人肺上皮細胞A549,進行細胞復蘇培養,經過細胞傳代,接種,計數并調整細胞濃度,將生長良好的指數生長期的A549細胞制成1×105的細胞懸液2mL,接種于6孔培養板,置于 37℃,5%CO2培養箱(Forma3110系列,USA)培養24h后,棄上清液,用D-Hanks液洗3次,加入含雙抗、不含小牛血清的DMEM培養液,每組樣品設3個平行,培養20h.分別加入5個濃度等級的PM10溶液進行染毒,培養20h,收集細胞培養液,用PBS洗2次,胰酶消化,細胞與原細胞培養液合并,4℃,1000r/min離心12min,細胞用PBS重新懸浮,1000r/min離心1min,倒掉上清液,用 200μL binding buffer懸浮細胞,過 200 目篩,加6μL 的 Annexin-V,避光靜置 15min,加 3μL 的碘化丙啶(PI),上流式細胞儀進行分析.

1.5 細胞計數與統計分析

采用流式細胞儀進行細胞計數分析.AnnexinV-FITC/PI雙染檢測法是目前較為理想的檢測細胞凋亡的方法[13].未發生凋亡細胞的膜結構及功能完整,胞膜沒有被染上綠色熒光(FITC-),細胞核完整且未被染上紅色熒光(PI-);早期凋亡的細胞膜結構完整,但是因為“膜翻轉”而被染上紅色熒光(FITC+);但因為膜結構完整,細胞核未被染上紅色熒光(PI-);晚期凋亡細胞膜完整性破壞,PI通過細胞膜進入細胞,細胞膜“翻轉”不完整的胞膜被染上綠色熒光,胞核被染上紅色熒光(FITC+/PI+).在本試驗中,由于顆粒物的毒性損傷,導致早期細胞膜喪失不對稱性,細胞膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)外露,早于DNA 斷裂[14],通過膜聯蛋白(Annexin-V)與 PS特異性結合、PI與壞死細胞結合可區分凋亡細胞與壞死細胞.

采用One-way-ANOVA進行凋亡率的計算,凋亡率=(凋亡細胞數/10000)×100%.數據采用SPSS16.0統計軟件的一般線性模型的Multivariate過程進行多元方差分析.

2 結果

表2是通過流式細胞儀檢測并計數得到的肺泡上皮細胞的凋亡率.

表2 PM10顆粒物懸浮液作用下A549總凋亡率(%)Table2 Apoptosis rate induced by PM10 solution(%)

方差齊性檢驗表明,虎頭村與寧家灣村 2組PM10樣本的Levene統計量為225.486(P＜0.001),可以認為樣本所在各總體的方差齊.對不同來源、不同濃度的PM10下肺泡上皮細胞單因素方差分析,虎頭村組室內 PM10樣本對肺上皮細胞凋亡的影響與寧家灣組差異顯著(F=3124.522,P＜0.001),而且各組內不同濃度對肺上皮細胞凋亡的影響差異顯著(P＜0.001).用 S-N-K 法進行兩兩比較,寧家灣村室內 PM10樣本在 25,50μg/mL濃度下肺泡上皮細胞死亡率沒有差異(P=0.671,P＞0.01);虎頭村室內 PM10樣本在25,50μg/mL濃度下對肺泡上皮細胞凋亡率沒有差異(P=0.026,P＞0.01);其余被歸入不同亞組(P＜0.001),表明對肺上皮細胞的死亡或凋亡有差異.由表 3可以看出,虎頭村組室內 PM10作用下肺上皮細胞死亡或凋亡率大于寧家灣組,2組樣本作用下細胞的凋亡率和死亡率,隨著的室內PM10濃度增加而提高.

表3 組別與濃度主效應交互作用結果Table 3 Analysis of the main effects interaction between groups and concentrations

3 討論

正常凋亡是由多基因嚴格控制的、遵循自身程序的主動、高度有序的過程,但如果細胞受到外界因素的干擾,則會影響細胞的凋亡過程,表現在細胞凋亡過程處于各周期細胞數量的變化.在本研究中,室內 PM10的誘導是肺泡細胞上皮細胞凋亡的病理條件,細胞計數分析顯示,細胞凋亡率隨著濃度增加而增加,組間對比,同一濃度下虎頭村凋亡率大于寧家灣組,具有顯著性差異(P＜0.001).在寧家灣村組內比較,在較低濃度下(＜50μg/mL)PM10對肺泡上皮細胞凋亡的影響沒有差異.但濃度較高時,隨著濃度增加,細胞凋亡率明顯增加,這可能由于較高濃度下顆粒物的體積、顯微形貌、顆粒的聚集特性等理化性質對細胞的凋亡有一定影響.PM10生物活性研究表明,虎頭村的PM10具有較強氧化性損傷能力[15],顆粒物自身的表面吸附的過渡金屬金屬等誘導細胞產生自由基,尤其是活性氧(ROS),它們會對細胞DNA造成顯著的傷害,引起DNA的單鏈或雙鏈斷裂.細胞凋亡存在的3條途徑:線粒體通路、內質網通路和死亡受體通路均與 ROS密切相關[16],因此推斷,較強氧化性損傷能力可能是虎頭村PM10樣品影響肺泡上皮細胞的凋亡主要原因之一.

宣威肺癌產生機理至今尚不明確,室內PM10組成和來源非常復雜,是多種污染物的載體和催化劑,包括多種PAHs及其衍生物、含氧雜環化合物、金屬元素及其化合物、硫酸鹽、硝酸鹽、各種生物氣溶膠等,致毒機理也并非一種機理能夠解釋.PM10影響肺組織細胞的凋亡,損害遺傳物質和干擾細胞正常分裂,而長期接觸 PM10導致上皮細胞和巨噬細胞內的細胞因子增加;PM10污染物作用于細胞產生的一些細胞因子如生長因子,可能導致細胞周期失去正常調節,從而使細胞分裂增加,進一步形成肺癌.

4 結語

宣威肺癌高發區虎頭村室內PM10對人肺泡上皮細胞凋亡的影響大于對照點肺癌低發區室內PM10,可能是虎頭村肺癌高發的重要因素之一.因此改善居民居住環境和生活條件,控制室內PM10的濃度,對降低虎頭村肺癌發病率具有積極作用.

[1]Mumford J, He X-Z, Champman R, et al. Lung cancer and indoor and pollution in Xuan Wei, China [J]. Science, 1987:217-235.

[2]Marineola F, Jaffee E, Hicklin D, et al. Escape of human solid tumors from T cell recognition: molecular mechanisms and functional significance [J]. Adv. Immunol., 2000,74:181-273.

[3]何興舟,藍 青,楊儒道.宣威肺癌危險因素研究概述 [J]. 衛生研究, 1995,24(4):203-206.

[4]Lan Q, Chen W. Risk factors for lung cancer in non-smokers in Xuanwei County of China [J]. Biomedical and Environmental Sciences, 1993,6(2):11-28.

[5]何興舟,楊儒道.室內燃煤空氣污染與肺癌 [M]. 昆明:云南科技出版社, 1994:197.

[6]Hunter T, Pines J. Cyclins and cancer. II: Cyelin D and CDK inhibitors come of age [J]. Cell, 1994,79(4):573-582.

[7]Sherr C. G1 phase progression: cycling on cue [J]. Cell, 1994,79(4):551-555.

[8]Sherr C. Mammalian G1 cyclins [J]. Cell, 1993,73(6):1059-1065.

[9]雷 雨.云南宣威肺癌HLA－A02高分辨率研究 [D]. 昆明:昆明醫學院, 2007.

[10]Tian L W, Donald Lucas, Susan L, et al. Particle and gas emissions from a simulated coal-burning household fire pit [J].Environ. Sci. Technol., 2008,42(7):2503-2508.

[11]David J Large, Shona Kelly, Baruch Spiro, et al. Silica-volatile interaction and the geological cause of the Xuan Wei lung cancer epidemic [J]. Environ. Sci. Technol., 2009,43(23):9016-9021.

[12]Fadok V A, Voelker D R, Campbell P A, et al. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages [J].Immunol., 1992,148(7):2207-2216.

[13]Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H, et al. A novel assay for apoptosis flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluoresce in labeled Annexin V [J]. Immunol. Methods, 1995,184(1):39-51.

[14]Aravind L, Dixit V M, Koonin E V. The domains of death:evolution of the apoptosis machinery [J]. Trends Biochem. Sci.,1999,24(2):47-53.

[15]邵龍義,楊園園,吳明遠,等.宣威農村肺癌高發區室內PM10的生物活性及其與微量元素組成的關系 [J]. 環境與健康雜志,2008,25(12):282-287.

[16]劉 卉,劉延香.細胞凋亡與活性氧 [J]. 現代腫瘤醫學, 2008,16(10):1380-1382.

致謝：衷心感謝北京聯合大學應用文理學院趙曉紅教授對細胞實驗部分的指導,感謝宣威市虎頭村衛生室代普飛在采樣過程中給予的幫助.