兔角膜中央厚度與角膜上皮厚度的相關研究

鄭紹斌 徐國興 林泰南 張曉娟 黃曉敏

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兔角膜中央厚度與角膜上皮厚度的相關研究

鄭紹斌1徐國興1林泰南2張曉娟1黃曉敏1

1.福建醫科大學附屬第一醫院眼科準分子激光中心 2.福建省級機關醫院

目的：探討兔的角膜上皮厚度在A型超聲下與共焦下測量結果的相關性，及表麻藥對角膜上皮的作用。方法：分析左右眼之間的統計學差別后，將20只兔子隨機分為兩組，一組滴用表麻藥為實驗組，另一組點用平衡液作為對照組，分析表麻藥對角膜上皮的影響；最后將對照組用同樣方法處理后，將40只眼的角膜上皮在A超下與共焦下的測量值進行統計學分析。結果：（1）兔的眼別與角膜中央厚度的測量差異無統計學意義；（2）滴用倍諾喜表麻液與滴用平衡液兩組差異有統計學意義；（3）A超下測量角膜中央厚度與角膜上皮厚度，二者呈正相關；（4）A超下與共焦下的測量的角膜上皮厚度呈正相關。結論：倍諾喜表麻液會使角膜上皮厚度增加,可使角膜上皮的松解，可以縮短乙醇浸泡角膜上皮的時間；A超下測量角膜中央厚度越厚，其角膜上皮厚度越厚；A超下測量角膜上皮越厚，其共焦下測量角膜上皮也越厚。

兔 角膜上皮厚度 A型超聲 共焦顯微鏡

活體的角膜中央厚度（CCT）的測量方法有A型超聲波角膜測厚儀、UBM、光學裂隙燈測厚儀、眼前節光學相干斷層掃描、Orbscan裂隙掃描角膜地形圖/角膜測厚系統及共焦顯微鏡等,其中超聲角膜測量法是為準確的測量方法。我們用超聲測量法測量CCT。這些方法現多用于臨床測量,而測量死后角膜厚度的方法目前報道很少。活體的角膜通過普通切片來測量將會產生很大的誤差,因為在制片過程中的脫水會造成角膜的皺縮，從而影響角膜測量的準確性。因此，本實驗通過對兔的活體與死體角膜上皮之間關系的相關性研究；以及表麻藥物對角膜上皮影響的研究，為以后更廣泛地應用于臨床實踐提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要儀器材料

四川大學醫學實驗動物中心提供健康新西蘭大耳白兔20 只40 眼。兔齡3~4月；重量1.9~2.2kg；,雌雄兼用；經裂隙燈檢查均無眼前節病變。

A型超聲角膜測厚儀（DGH.technology INC.exton.PA.USA），美國思博明科學器材公司，在共聚焦顯微鏡圖像分析系統下進行角膜厚度測量。應用圖像分析系統本身載物臺標本移動距離測量角膜上皮厚度。

0.4%倍諾喜滴眼液（日本參天制藥株式會社）。

1.2 手術方法及實驗分組

實驗動物編號，耳緣靜脈注射水合氯醛后，采用隨機數字表法隨機取實驗動物1只眼作為實驗組，另1只眼作為對照 組。再對20只兔采用區組隨機法,分成2組,每組10只。A型超聲角膜測厚儀測量中央角膜厚度各3次取平均值。

1.3 組織病理學研究

取材固定：用顯微鑷于兔的角膜中央固定區取直徑約6mm的角膜上皮,立即測量去上皮角膜厚度，同時標本固定于4%中性甲醛中4 h,常規脫水、角膜上皮沿中央剪開，豎立石蠟包埋，5μm厚連續切片,常規HE染色，直接用共聚焦圖像分析系統進行角膜上皮厚度測量。

1.4 圖像分析

圖像分析系統對HE染色標本進行角膜上皮測厚。上皮厚度的計算方法是取切削區中點、邊界點以及兩點之間的中心點,共5個點,上端起于上皮表面,下端止于基底膜上,平均值即為角膜上皮厚度。

2 步驟

2.1 水合氯醛自兔耳緣靜脈注入，待兔進入全麻狀態后，乙醇消毒鋪巾，用復方乳酸林格液做溶劑的8%妥布霉素溶液沖洗結膜囊。

2.2 測量角膜厚度統一用A超，點一滴表麻藥（0.4%倍諾喜）于結膜囊內（約2cm高度）60秒后進行，測三次結果取平均值。

2.3 將新鮮配制的濃度為20%的乙醇溶液（lmL純度為99.7%的無水乙醇中加入4.0mL注射用蒸餾水）0.15mL置于上皮環鉆內，浸潤時間25s后，吸血海棉吸干乙醇，BSS立即充分沖洗，避免損傷上皮。同時A超角膜測厚儀立即測量去上皮后的角膜中央厚度。

2.4 取下的角膜和角膜上皮片固定:在4℃下，4%的甲醛溶液中固定4小時（4℃），0.1mol/L的磷酸緩沖液中漂洗1小時(換液3次)。再逐級脫水：60%乙醇 (20分鐘)，70%乙醇 (20分鐘)，80%乙醇 (20分鐘)，95%乙醇 (25分鐘)，無水乙醇 (25分鐘)，二甲苯（20分鐘），浸蠟，包埋。角膜上皮及角膜平鋪，顯微鏡下沿中央剪開，豎立包埋角膜上皮及角膜后，縱向切片5μm厚連續切片。

2.5 切片組織蘇木素—伊紅(HE)染色，共聚焦顯微鏡下圖像分析系統測量角膜上皮厚度。

2.6 統計學處理所有數據均使用SPSS11.5統計處理軟件包。組之間進行統計學分析比較，組內各小組之間進行統計學分析比較，數據以均數±標準差(X±S)表示，采用檢驗及二元變量相關分析。以<0.05時差異有統計學意義。

3 結果

3.1 未麻時左右眼A超的角膜厚度值結果如下（n=20，單位：μm）：

右眼 左眼 t P 357.55±16.5 350.50±13.02 2.27 0.128

3.2 滴用倍諾喜表麻液（實驗組）與滴用平衡液組（對照組）結果如下（n=20，單位：μm）：

倍諾喜組 平衡液組 t P 360.75±17.53 351.30±15.76 1.79 0.041

P＝0.041＜0.05，有統計學意義；說明表麻液可使角膜上皮厚度增加。

3.3 A超下角膜中央厚度與角膜上皮厚度的測量值如下（n=40，單位：μm）：

角膜中央厚度 角膜上皮厚度 r p 348.50±19.02 25.00±5.50 0.579 0.037

采用二元變量相關分析，相關系數r=0.579，P＝0.037，說明二者呈正相關；即A超下的角膜中央厚度越厚，其角膜上皮厚度越厚。

3.4 A超下與共焦下的角膜上皮厚度的測量值如下（n=40，單位：μm）：

A超下 共焦下 r p 25.00±5.50 16.56±6.93 0.593 ＜0.001

采用二元變量相關分析，相關系數r=0.593，P<0.001，說明二者呈高度相關；即A超下的角膜上皮越厚，共焦下的角膜上皮越厚。

4 討論

許多實驗和臨床現象都說明滲透壓對于維持角膜處于一個脫水狀態是一個不可缺少的因素[1]。活體角膜之所以能夠始終保持透明和相對脫水狀態,是通過角膜內皮細胞的主動的代謝性液泵作用和把房水與角膜基質隔開的機械性屏障作用來實現的。人體或動物死亡后角膜內皮進入到基質,使得基質層腫脹,而基質層占角膜厚度的90% ,故而使角膜增厚,透明度下降；活體的角膜厚度的測量方法有很多種, 如A型超聲波角膜測厚儀、UBM、光學裂隙燈測厚儀、眼前節光學相干斷層掃描、Orbscan裂隙掃描角膜地形圖/角膜測厚系統及共焦顯微鏡等。其中超聲波角膜測量法是較為準確的測量方法[2，3]。我們用超聲測量法測量CCT。這些方法現多用于臨床測量,而測量死后角膜厚度的方法目前報道很少。活體角膜通過普通切片來測量將會產生很大的誤差,因為在制片過程中的脫水會造成角膜的皺縮，從而影響角膜測量的準確性。因此，我們將角膜上皮剝離后立即置于4%甲醛中固定。我們通過對兔的活體與死體角膜上皮之間關系的相關性研究，為以后更廣泛地應用于臨床實踐提供依據。

我們在對各組左眼、右眼角膜中央厚度比較，用統計學分析（成組T檢驗），發現左右眼角膜中央厚度沒有顯著差別，說明在該研究中眼別的影響不大。這與多數學者研究報道相似。現多數研究報道CCT與性別，年齡無顯著性意義[3，10]。故我們就不對CCT與性別、年齡之間關系進行研究，直接對成年雌雄兔研究。

對于LASEK手術，其優勢是要制作高生物學活性的角膜上皮瓣[4]，多數學者[5，6，7，8]現較一致認為20%乙醇作用于角膜上皮細胞的浸潤時間應為20~30 s，在本實驗中我們浸泡時間亦為25s。Espana[9]等人用免疫熒光染色的方法研究浸潤于20％乙醇20～25s后并施以LASEK 手術的角膜上皮瓣。得出結論：乙醇浸泡后制作出的上皮瓣，其分離層面位于上皮基底膜的透明層和致密層之間。我們對于倍諾喜表麻藥作用的研究，測量的角膜厚度均有統計學意義，說明倍諾喜表麻藥可增加角膜上皮的厚度，也可促使角膜上皮的松解，或許可縮短乙醇浸泡角膜上皮的時間。我們在研究中均由同個人滴入兔眼結膜囊，高度為2cm（瓶口距眼瞼水平面）。由于倍諾喜在24s就起效，可維持9~11min，為了使藥物充分起效，我們選擇滴藥后60s進行研究。

我們對A超下角膜中央厚度與角膜上皮厚度與的相關分析（采用二元變量相關分析），二者呈正相關（r=0.579，P＝0.037）；因此A超下兔角膜中央厚度與角膜上皮厚度呈正相關，即角膜越厚，角膜上皮就越厚，這為我們以后研究提供可行性。

A超下角膜上皮厚度與共焦顯微鏡下角膜上皮厚度相關分析（采用二元變量相關分析），說明二者高度相關（r=0.593，P≤0.001）；本實驗活體角膜上皮厚度是用A型超聲角膜測后儀測量的角膜厚度減去去角膜上皮的角膜厚度；最后我們也把對照組用同種方法去角膜上皮，使該相關研究的例數增加為40例。因此，經過統計學分析后，共焦顯微鏡下兔的角膜上皮厚度與A超下角膜上皮厚度呈正相關，即A超下測量角膜上皮越厚，其共焦下測量角膜上皮也越厚。為以后進一步研究角膜上皮與角膜厚度之間的關系提供相關依據。

盡管我們發現角膜上皮隨角膜厚度而變化，,且相關性強,較真實地反映實際情況。但本研究是動物實驗,動物與人存在種屬差異,且我們采用的均是健康兔,死因一致,同時還控制了溫度和濕度等實驗條件。這樣,和日常人所處的環境條件、個體差異、健康狀況、手術條件等影響均相似[10]。因此,必須了解各種影響因素對其作用規律,才能使角膜厚度與角膜上皮的相關性研究更加合理，準確，為以后更廣泛進一步地應用于臨床實踐提供依據。

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福建省科技廳重點項目基金資助(2006Y0013)。