鼠李糖脂生物表面活性劑及其純化方法研究進展

田 靜 ,王 靖 ,冀 光 ,李 明

(中國石油大學(北京）化學科學與工程學院,北京 102249）

鼠李糖脂生物表面活性劑及其純化方法研究進展

田 靜 ,王 靖 ,冀 光 ,李 明

(中國石油大學(北京）化學科學與工程學院,北京 102249）

鼠李糖脂生物表面活性劑是由微生物在一定的培養條件下分泌的次級代謝產物,具有良好的環境相容性,生產成本是制約其工業化應用的主要因素。綜述了鼠李糖脂的常用純化方法,并對其研究方向進行了展望。

鼠李糖脂;生物表面活性劑;純化;展望

生物表面活性劑是天然表面活性劑的一種,是微生物在特定條件培養時分泌的具有表面活性的一類代謝產物[1～3]。其中研究較多的是鼠李糖脂生物表面活性劑。與化學表面活性劑相比,鼠李糖脂生物表面活性劑除了具有類似的分子結構、一定的表/界面活性外,還表現出良好的環境和生物兼容性,即具有無毒、無害、易降解的特性。因此,近年來廣泛用于環境治理、石油開采、生物醫藥、造紙及化妝品等領域[4～8],并逐步拓展其它領域的研究應用。

由于化學表面活性劑合成步驟復雜、生產成本固定,而鼠李糖脂生物表面活性劑可以通過選擇經濟實用的分離方法、優化操作工序來降低成本。因此,尋找經濟、實用、高效的分離純化生物表面活性劑的方法已經成為科研工作者急需解決的問題。

作者在此綜述了鼠李糖脂常用的純化方法,擬為相關研究提供理論及技術基礎。

1 鼠李糖脂的結構

鼠李糖脂主要有4種結構[9,10],如圖1所示。

圖1 銅綠假單胞菌合成的4種鼠李糖脂的結構Fig.1 Structures of four rhamnolipids produced by P.aeruginosa

2 鼠李糖脂的生物合成途徑

鼠李糖脂公認的生物合成途徑由Burger等[11]和Ochsner等[12]通過放射性同位素標記前體物質的方法研究并提出(圖2）。在此合成途徑中,鼠李糖脂的合成是由一系列連續的糖基轉移反應完成的,每個反應過程均由特定的鼠李糖脂轉移酶進行催化,其中腺苷二磷酸鼠李糖(d TDP2L-鼠李糖）作為糖基的供體,L-鼠李糖苷-β-羥基癸酰-β-羥基癸酸和β-羥基癸酰-β-羥基癸酸分別作為糖基的受體。

圖2 鼠李糖脂的生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic route of rhamnolipids

3 鼠李糖脂的純化方法

3.1 預處理微生物發酵液

微生物產鼠李糖脂,一般分泌在細胞外,易貼附于細胞壁上,因此,在分離純化之前,要進行預處理,通過離心等操作將菌體細胞與培養液分開。

3.2 鼠李糖脂的分離純化

根據分離方法的不同,鼠李糖脂的分離純化分為初級純化和隨程提取。

3.2.1 初級純化

(1）沉淀法:微生物發酵液預處理之后,加入酸使生物表面活性劑沉淀[13],同時進一步去除培養液中殘留的菌體細胞。具體方法是:向處理后的發酵液中加入酸類物質,使其最終p H值達到2～ 3;在4℃下放置,觀察是否有白色沉淀產生(生物表面活性劑不同,產生沉淀的時間也有所不同）,若有白色沉淀產生則產物是脂肽類表面活性劑,若沒有白色沉淀產生則是水溶性表面活性劑,離心收集沉淀。為了除去沉淀中夾帶的酸性物質,可以選擇合適的緩沖溶液重懸沉淀物[14]。

一般來說,在萃取前酸化發酵液沉淀產物可以提高萃取量。

(2）有機溶劑萃取法:有機溶劑萃取法是初步分離純化技術,常用于去除水溶性雜質。其原理是:利用物質在互不相溶的兩相中分配系數的差異而使物質達到分離的目的。戊烷、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇以及氯仿/甲醇等有機溶劑常被用于生物表面活性劑的分離純化[15～17]。王靖等[18]采用酸沉淀和有機溶劑萃取的方法篩選出的銅綠假單胞菌株Lz221,能以原油為碳源產鼠李糖脂表面活性劑。具體操作是:將發酵液離心去除菌體,用6 mol·L-1的鹽酸調上清液p H值為2.0,用等體積的乙酸乙酯萃取2次,合并有機相,40℃減壓蒸餾,得到黃色油狀的鼠李糖脂粗產品。

分離較低親水、親油平衡性的非離子型糖脂類表面活性劑時,一般采用極性較低的甲基叔丁基醚(M TBE）作為萃取劑,這是因為M TBE具有不易燃、低毒性、可生物降解等優點,適用于生物表面活性劑的工業萃取。

3.2.2 隨程提取

(1）吸附法:根據疏水程度,通常采用聚苯乙烯樹脂或苯酚甲醛離子交換樹脂等同時具有吸附和解吸作用的疏水性的兩性物質進行吸附。基本步驟[19]是:將微生物發酵液離心后的上清液直接倒入裝有吸附劑的吸附柱中,用0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液調p H值至6.1(吸附劑的消耗可以通過測量表面張力得到）;用蒸餾水洗滌吸附劑去除可溶性物質及游離脂肪酸;用有機溶劑將生物表面活性劑洗脫下來,旋轉蒸發后得到生物表面活性劑粗品;將粗品溶解在適當的緩沖溶液中,用色譜法進一步純化生物表面活性劑。使用過的吸附劑用1 mol·L-1的NaOH溶液再生循環使用。

吸附過程通常在40℃、p H值5～10的條件下進行,而脫附或解吸過程通常在30℃才能盡可能多地回收生物表面活性劑。活性炭相對于其它吸附劑在上述條件下能表現出良好的吸附性能,而且使用壽命長,能從生物表面活性劑中脫除絕大多數水溶性物質,是目前廣泛使用的吸附劑。

相對于萃取法,吸附法除了可以用于連續提取外,還能減少有機溶劑用量,節約成本。

(2）膜濾法:膜濾法是利用膜表面的微孔結構對物質進行選擇性分離的處理技術。當液體混合物在一定壓力下流經膜表面時,小分子溶質透過膜(稱為濾液）,而大分子物質被截留,使原液中大分子濃度逐漸增大(稱為濃縮液）,從而實現大、小分子的分離,達到濃縮和凈化的目的。

近年來,膜濾法已經成為提取純化生物表面活性劑的主要方法。根據生物表面活性劑結構大小的不同,選用不同型號的薄膜。低p H值條件下,生物表面活性劑濃度在臨界膠束濃度(CMC）以上時,蛋白質和發酵液中的其它物質更促進了生物表面活性劑聚集成膠束[20],以致無法通過薄膜;但加入有機溶劑后,膠束會自行分散,生物表面活性劑隨溶劑透過薄膜。運用此原理分別對原發酵液、初級濾液和甲醇處理過的次級濾液進行高效液相色譜分析[21]。結果發現,如果有峰在原發酵液中出現、在初級濾液中消失、在次級濾液中重新出現,則該峰為表面活性劑特征吸收峰;生物大分子在甲醇的作用下不會裂解,只會失活,因此只會在原發酵液中出現,不會在初級和次級濾液中出現,不會造成干擾。

膜濾法對產品損失很小,但是過濾層的積累會加大滲透壓力,造成溶劑流動的附加壓力,從而影響溶劑通過膜層的流動,對操作不利。因此,過濾時,應在膜表面處進行混合攪拌,抑制過濾層的形成。

(3）泡沫分離法:泡沫分離法是連續提取的新方法,與膜濾法類似,利用了生物表面活性劑在臨界膠束濃度以上形成膠束的特性。微生物的好氧發酵過程中,在充氧和快速攪拌的作用下產生泡沫,生物表面活性劑膠束在其中穩定存在。目的產物在泡沫上的吸附取決于p H值、離子強度和其它表面活性物質的濃度等[22,23]。隨著在分離柱中停留時間的延長,重力作用使泡沫中水相液體下沉,有利于目的產物的回收。因此,可以從生物反應器中分離出泡沫,通過酸處理或離心處理使膠束分散,獲得生物表面活性劑粗品。

3.3 不同純化方法的優缺點比較

針對不同的生物表面活性劑,根據其性質的差異,應該選擇合適的分離純化方法。不同分離純化方法的優缺點比較見表1。

表1 不同純化方法的優缺點比較Tab11 Comparison of different purification methods

4 展望

鼠李糖脂生物表面活性劑相對于化學表面活性劑具有環境友好、經濟實用等優點,因此在微生物采油領域具有很好的應用前景,如菌株Lz-21所產鼠李糖脂的臨界膠束濃度為0.63 g·L-1,接種24 h后其發酵液的表面張力達到最低值28 m N·m-1,對原油的乳化指數達78.6%,培養7 d后鼠李糖脂的濃度約為1.8 g·L-1。因此,菌株Lz-21能夠有效降解原油,提高原油采收率,同時也可以用于修復烴類污染。由于精細化工領域對表面活性劑精度要求較高,導致生物表面活性劑的生產成本比化學表面活性劑要高出許多,所以生產成本是制約生物表面活性劑廣泛應用的主要因素。要降低生產成本,一方面可以采用細胞融合技術等遺傳工程手段將多種降解基因轉入到同一微生物中構建基因工程菌,提高菌株產表面活性劑能力;另一方面,可以優化表面活性劑的分離純化操作。在節約成本的前提下,宜綜合運用多種方法,同時結合先進的技術手段(如色譜、光譜技術等）,開發出更多更好的分離純化方法。

[1]Das P,Mukherjee S,Sen R.Genetic regulation of the biosynthesis of microbial surfactants:An overview[J].Biotechnology and Gen- et Eng Rev,2008,25:165-186.

[2]M ukherjee S,Das P,Sen R.Towards commercial production of mi2 crobial surfactants[J].Trends Biotechnol,2006,24(11）:509-515.

[3]Christofi N,Ivshina IB.Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation[J].J Appl Microbiol,2002,93(6）:915-9-9.

[4]Cameotra S S,Makkar R S.Recent applications of biosurfactants as biological and immunological molecules[J].Curr Opin Microbi-ol,2004,7(3）:262-266.

[5]陳文求,孫爭光.生物表面活性劑的生產與應用[J].膠體與聚合物,2007,25(3）:45-46.

[6]Desai J D,Banat IM.Microbial production of surfactants and their commercial potential[J].Microbiol Mol Biol Rev,1997,61(1）:47-64.

[7]Rodrigues L,BanatIM,Teixeria J,et al.Biosurfactants:Potential applications in medicine[J].Antimicrob Chemother,2006,57(4）:609-618.

[8]Das P,Mukherjee S,Sen R.Antimicrobial potential of a lipopep- tide biosurfactant derived from a marine Bacillus circulans[J].Appl Microbiol,2008,104(6）:1675-1684.

[9]Hisatsuka K,Nakahara T,Sano N,et al.Formation of rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa and its function in hydrocarbon fer- mentation[J].Agricultural and Biological Chemistry,1971,35:686-692.

[10]Guerra-Santos L,Kappeli O,Fiechter A.Pseudomonas aerugino- sa biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source[J].Applied and Environmental Microbiology,1984,48(2）:301-305.

[11]Burger M M,Glaser L,Burton R M.The enzymatic synthesis of a rhamnose-containing glycolipid by extracts of Pseudomonas aeruginosa[J].J Biol Chem,1963,238:2595-2602.

[12]Ochsner U A,Hembach T,Fiechter A.Production of rhamnolip- id biosurfactants[J].Advances in Biochemical Engineering Bio- technology,1996,53:89-118.

[13]Prabhu Y,Phale PS.Biodegradation of phenanthrene by Pseudo- monas sp.strain PP2:Novelmetabolic pathway,role of biosurfac- tant and cell surface hydrophobicity in hydrocarbon assimilation[J].Appl Microbiol Biotechnol,2003,61(4）:342-351.

[14]梁生康,王修林,陸金仁,等.假單胞菌O-2-2產鼠李糖脂的結構表征及理化性質[J].精細化工,2005,22(7）:499-502.

[15]Yin Hua,Qiang Jing,Jia Yan,et al.Characteristics of biosurfac- tant produced by Pseudomonas aeruginosa S6 isolated from oiL- containing w astewater[J].Process Biochemistry,2009,44(3）:302-308.

[16]Das K,Mukherjee A K.Crude petroleum-oil biodegradation effi-ciency of Bacillussubtilis and Pseudomonas aeruginosa strains i- solated from a petroleum-oil contaminated soil from North-East India[J].Bioresource Technology,2007,98(7）:1339-1345.

[17]Sivapathasekaran C,Mukherjee Soumen,Samanta Ramapati,et al.High-performance liquid chromatography purification of bio- surfactant isoforms produced by a marine bacterium[J].Anal Bioanal Chem,2009,395(3）:845-854.

[18]王靖,章厚名,安明泉,等.高效產表面活性劑菌株(Lz-21）的篩選及其特性研究[J].石油化工高等學校學報,2009,22(3）:33-36.

[19]Ahimou F,Jacques Philippe,Deleu Magali,et al.Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface hydrophobicity[J].Enzyme and Microbial Technology,2000,27(10）:749-754.

[20]Heyd M,Kohnert A,Tan T H,et al.Development and trends of biosurfactant analysis and purification using rhamnolipids as an example[J].Anal Bioanal Chem,2008,391(5）:1579-1590.

[21]傅海燕,曾光明,袁興中,等.生物表面活性劑的分離提純及其發展前景[J].生物學雜志,2003,20(6）:1-4.

[22]Sarachat Thitima,Pornsunthorntawee Orathai,Chavadej S,et al.Purification and concentration of a rhamnolipid biosurfactant pro-duced by Pseudomonas aeruginosa SP4 using foam fractionation[J].Bioresource Technology,2010,101(1）:324-330.

[23]Lotfabada Tayebe Bagheri,Shourianc Mitra,Roostaazada Reza,et al.An efficient biosurfactant-producing bacterium Pseudo- monas aeruginosa MR01,isolated from oil excavation areas in south of Iran[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2009,69(2）:183-193.

Research Progress of Rhamnolipid Biosurfactant and Its Purification Methods

TIAN Jing,WANG Jing,JIGuang,LIMing
(Faculty of Chemical Science&Engineering,China University of Petroleum,Beijing 102249,China）

Rhamnolipid biosurfactant is the secondary metabolites secreted by microorganism s under certain culture conditions.It has a good environmental compatibility,but the cost of production is the major limiting factor in its industrial applications.The review is outlined in terms of the methods in purification of rhamnolip- id.The development trend of this field in the future is forecasted.

rhamnolipid;biosurfactant;purification;p rospect

TQ 423

A

1672-5425(2010）06-0013-04

國家科技部863課題子課題基金資助項目(2009AA 063504）,中石油天然氣股份有限公司科技管理部科技開發基金資助項目(2008A21403）

2010-03-09

田靜(1987-）,女,黑龍江人,碩士研究生,研究方向:應用微生物學、微生物采油;通訊作者:王靖,博士,教授。E-mail:tianjing1-001@163.com,sw hgw j898@cup.edu.cn。