福建省分離的HIV-1 Thai-B亞型感染性克隆的構建及序列分析

吳守麗 顏蘋蘋 黃海龍 王惠榕 嚴延生

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福建省分離的HIV-1 Thai-B亞型感染性克隆的構建及序列分析

吳守麗 顏蘋蘋 黃海龍 王惠榕 嚴延生

福建省疾病預防控制中心

中國自1985年出現第一例艾滋病病人以來[1]，20多年來艾滋病流行經歷了傳入期、播散期和快速增長期三個階段，全國 31 個省、市、自治區均有病例報告。截至2009年底，估計中國目前存活艾滋病病毒感染者和病人（HIV/AIDS）約74萬人。最新的分子流調結果顯示，我國目前流行的主要毒株是Thai-B(44%)，C（29%，主要為 CRF08_BC）和 CRF01_AE (13%)其中 CRF07_BC 和 CRF08_BC 是中國特有的流行毒株，是由 Thai-B 亞型和C 亞型重組而成，而且 Thai-B 亞型已經取代了歐美 B 亞型（prototype B）成為我國流行率最高的病毒亞型[2-4]。Thai-B亞型最早是發現于泰國曼谷的靜脈吸毒人群，與歐美B亞型相比，兩亞型的膜區序列聚集在一起，可是又位于不同的進化樹分支上，故又被命名為Thai-B亞型，其主要特征是在Env基因的V3 loop區存在14（I-L）、22（F-W）和28（D-Q）的氨基酸置換[5]。目前該亞型除了在泰國傳播流行外，還在亞洲其他國家如中國，馬來西亞，日本等地傳播并成為當地的主要流行毒株。

自1986年Adachi 通過噬菌體克隆首次獲得HIV的感染性克隆pNL4-3成功構建以來[6]，感染性克隆構建技術得到不斷的完善，迄今為止，構建成功的感染性克隆已經涵蓋數種亞型，包括A,B,Thai-B, C,D,O,AG,AE,BC,D/C等亞型[7-20]，其中絕大部分是流行于歐美的B亞型毒株。在針對流行于中國的HIV-1病毒構建的感染性克隆研究中，有報告的僅有2株，其中1株來自新疆靜脈吸毒人群中的病毒，為CRF07_BC重組亞型[20]，另1株是來自河南賣血人群中的病毒，為Thai-B亞型[10]。這兩毒株來源均具有獨特的區域代表性。為了進一步了解Thai-B亞型毒株的一些生物學特性及該亞型在福建省可能的傳播途徑，也為構建表型耐藥檢測提供必要研究工具，我們在前期研究基礎上選取一株可持續傳代、快/高復制、T細胞噬性的合胞體誘導株進行全長基因組序列分析，并在此基礎上構建感染性克隆。

1 材料與方法

1.1 毒株來源

由福建省疾病預防控制中心確認并分離的HIV-1毒株lwj，該毒株分離于一名患隱球菌性腦膜炎的艾滋病患者，自稱是經輸血/血制品感染。經異源雙鏈泳動分析及小片段DNA序列測定鑒定為Thai-B亞型，該毒株可以在原代人PBMCs和傳代人T淋巴細胞系（MT4）上復制并導致細胞病變（CPE），為可持續傳代、快/高復制、T細胞噬性的SI毒株[21]。

1.2 plwj全長基因組克隆的構建

用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)提取病毒感染細胞中基因組DNA。根據參考序列設計兩對前后半長引物，應用Expand long template PCR system ( Roche)，使用熱啟動技術進行長片段PCR擴增，5’前半長片段擴增引物是：5’-LTR (5’-TGGATGGGCTAATTTACTCCAAGAAAAGACAAG-3’) 和Half-vif (5’-CCTTTTCTCCTGTCTGCAGACCCCAATATG-3’)，其擴增區域為5’LTR到 vif 約5.2kb；3’后半長片段擴增引物是：Halfs-wai (5' CGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGACC 3')和 3’-LTR5’-TGCTAGAGATTTTTACTCAGTCTAGAG(TGGT CTGAG-3’)，其擴增區域為vif 到 3’LTR約4.8kb，其前后半長在vif區有部分重疊。PCR 反應條件：94℃ 2 min，1 個循環；94℃ 10 sec，57℃ 30 sec，68℃ 5 min50 sec，10 個循環；94℃ 15 sec，57℃ 30 sec，68℃ 5 min 50 sec，20個循環，每個循環遞增5 sec的延伸時間；68℃ 10 min。采用特殊的凝膠純化試劑（結晶紫），混合3次擴增樣品在可見光下進行切膠純化。用TOPO XL PCR Cloning Kit（Invitrogen）試劑盒，將lwj前后半長PCR 純化產物克隆到pCR-XL-TOPO T載體上，構建plwj-5’half 和plwj-3’half前后半長重組質粒。采用PCR 法對轉化獲得的單菌落進行快速篩選，挑出陽性克隆并進一步酶切和 DNA測序鑒定。對前后半長基因序列進行酶切圖譜分析，在前后半長Vif重疊區域找到I單一酶切位點，并利用載體上多克隆位點處限制性內切酶I，分別酶切plwj前后半長重組質粒，用 T4 DNA 連接酶將酶切后的lwj-3’half片段與plwj-5’half 載體進行連接。連接產物轉化DH5α感受態細菌。采用菌落PCR 法進行快速鑒定挑出陽性克隆并進一步用I/I雙酶切鑒定以篩選出正確的全基因組克隆，整個克隆構建策略見圖1。

圖1 plwj全長基因組克隆構建策略

1.3 plwj全基因組克隆轉染 293T 細胞產生衍生病毒

利用脂質體轉染法將陽性克隆plwj轉染293T細胞，培養72h后,離心，轉染上清經 0.45-μm過濾后進行 HIV-1 p24抗原檢測（Vironostika HIV-1 Antigen P24 Micro-ELISA System），以確定有無產生衍生病毒。

1.4 plwj全基因組克隆感染活性的鑒定

plwj全基因組克隆轉染上清（即衍生病毒）經0.45-μm過濾后用 p24 定量檢測試劑盒定量至 80ng/ml病毒，用 1.5ml 的病毒上清感染 3×106經PHA-P 刺激活化的正常 PBMCs，孵育 4-5h，離心棄上清，細胞用 10ml Hank’s 洗兩次后吸干上清以去除殘留的 p24 抗原。用 8ml 新鮮的T淋巴細胞生長液重懸細胞后置 37℃，5% CO2條件下培養12d，每隔3-4d 移去4 ml培養上清液，隨之補充4 ml新鮮的培養液，其中在第6d 補充3×106個經PHA-P激活了的正常的PBMCs。收集感染上清進行 p24 抗原檢測鑒定衍生病毒對 PBMCs的感染性。以上轉染及感染實驗在同等條件下重復兩次。

1.5 感染性克隆plwj全基因組序列分析

將感染性克隆plwj送交上海生工進行測序，使用Primer walking方法進行全基因組測序。將全長序列提交HIV databases 庫，利用其Sequence locator Tool進行序列定位。測得的序列用DNA STAR軟件進行編輯、校正后，使用clustal X軟件與HIV-1M組各亞型參考毒株序列進行多重排列、比較和同源性分析；用Bioedit軟件將序列長度編輯一致并進行格式轉換后，利用Mega軟件中neighbor-joining(N-J)method進行系統進化樹的構建，進化樹的可靠性使用Bootstrap分析，重復1000次。利用RIP 3.0軟件進行序列重組分析。整理后的序列提交Stanford HIV Drug Resistance Database (http://hivdb.stanford.edu)，利用該網站提供的耐藥序列分析軟件HIVdb進行分析，尋找耐藥相關突變。

2 結果

2.1 plwj全長基因組克隆的構建及鑒定

應用長鏈PCR技術將plwj全長基因組分5’和3’前后半長進行擴增，擴增結果見圖 2 ，5’前半長約為 5.2kb，3’后半長為 4.6kb。利用TA克隆技術將前后半長分別克隆入pCR-XL-TOPO載體上，共獲得12株plwj-5’前半長克隆(命名為plwj-5’ half 1-12)和4株plwj-3’后半長克隆（命名為plwj-3’half 3-6）。通過對全長 plwj 基因組的酶切位點分析,在 vif 重疊區基因發現一個I單一酶切位點，并利用載體上的單一酶切位點I，將plwj-5’和plwj-3’前后半長分別雙酶切后進行定向連接克隆，共獲得12株plwj全基因組克隆，利用載體多克隆位點兩端的I和I單一酶切位點對全基因組克隆進行雙酶切鑒定,共切出兩段，分別為近似HIV全長基因組片段（約9.8kb）及質粒載體片段（約3.5kb）。酶切片段大小均符合預期推斷，提示全基因組克隆構建成功。

1 H2O; 2 lwj-5’half; 3 lwj-3’half; 4 DNA Marker DL15000

2.2 衍生病毒的產生及其感染活性的鑒定

將12株plwj全基因組克隆分別轉染293T細胞，48~72小時后檢測轉染上清中p24抗原來確定其有無衍生病毒產生。轉染性實驗結果提示12株plwj全基因組克隆中有9株轉染上清p24抗原呈強陽性（OD>3.0），說明這些克隆株能在293T細胞內進行有效地病毒復制，并產生衍生病毒。轉染上清經0.45μm過濾后感染經PHA-P刺激活化的PBMCs細胞，通過觀察細胞病變產生情況并檢測感染上清中的p24抗原來鑒定其感染活性。感染性實驗結果顯示有2株全基因組克隆plwj10+6和plwj13+6的感染上清p24抗原呈強陽性（OD>3.0），有4株呈弱陽性（OD約0.8），其余的很低或呈陰性。此外，其中有兩株全基因組克隆（plwj2+6和plwj5+6）各自轉染上清感染PBMCs細胞時感染性很低或呈弱陽性，但當這兩株克隆質粒共轉染293T細胞所產生的混合衍生病毒感染PBMCs細胞時則表現出強陽性，結果見表1。

表1 plwj全基因組克隆轉染和感染上清中P24抗原值

aThe numeral of plwj 1+4 represents that the full-length clone plwj was constructed by ligation with plwj-5’half clone1 and plwj-3’half clone4, and so on.bClones plwj5+6 and plwj2+6 produced infectious virus upon cotransfection.

2.3 感染性克隆plwj全基因組序列分析

利用HIV databases 庫中Sequence locator 工具對全基因組序列進行定位，結果顯示plwj全長基因組共9719個堿基，包含了HIV-1所有的結構基因和調控序列。基因重組分析顯示該毒株與consensus-B同源性最高，屬于HIV-1 B亞型，且沒有明顯的與其它任何亞型序列發生遺傳重組的跡象（圖3）。將該序列與國際上HIV-1 M組各亞型參考株的全長序列進行系統進化樹分析（圖4），進一步證實plwj屬于HIV-1 B亞型的衍生株Thai-B亞型，而且與河南有償獻血人群中Thai-B亞型流行株02HNsc11、02HNsq4、02HNsmx2及CNHN24最為接近，相對遠離歐美B亞型毒株。序列耐藥分析發現plwj沒有導致現有抗病毒治療藥物（ARV）的耐藥突變，這與樣品采自中國開始大規模免費ARV治療之前的時間相一致。

圖3 plwj全長基因序列的重組分析

圖4 plwj全長基因序列的系統進化樹分析

病毒包膜的V3環是病毒感染細胞的主要決定簇，由特征性四肽組成。通過對V3環關鍵氨基酸的分析可預測HIV-1輔助受體的可能使用情況。如果這些關鍵的預測位點中精氨酸（R）被谷氨酰胺(Q)替換，HIV-1毒株則由使用CXCR4變為使用CCR5作為輔助受體進入細胞。我們分析了plwj全基因組克隆及其母本株lwj和河南Thai-B亞型代表株pCNHN24 的V3環主要氨基酸序列，結果顯示三者V3環頂端四肽均為GPGR，而且其第11位均為帶正電荷的精氨酸（R），見表2。因此，可預測plwj株與其它兩株相似是利用CXCR4作為輔助受體。

表2 plwj全基因組克隆V3環主要氨基酸序列

*圖中紅色標出V3 環第11位及頂端關鍵氨基酸序列

3 討論

長鏈擴增是困擾全長基因組克隆的難點之一。1994 年Barnes 和Cheng 等分別建立了長鏈PCR技術,使得幾十個kb 的基因組片段得到有效擴增。考慮到PCR擴增的忠實性，我們采用Roche公司的Expand long template PCR system，該系統采用熱穩定 Taq DNA 多聚酶和Tgo DNA 多聚酶混合物。該酶混合物不僅可以擴增長片段，而且具有很高的保真性。此外，為減少PCR 過程導致的點突變，混合3次PCR擴增產物，進行后續克隆。在克隆長片段時，我們曾嘗試用普通的克隆試劑盒，結果不理想，直到后來改用Topo XL PCR Cloning Kit。該系統是用DNA 拓撲異構酶（Topoisomerase）將PCR產物連接到載體上，整個反應只需5min，而一般T4連接酶需過夜才能高效連接。此外，該克隆載體還引入ccdB （Control of cell death）基因，這樣可以降低克隆背景，節省篩選的時間。特殊的凝膠純化試劑（結晶紫純化）使得可以直接在可見光下進行切膠純化，這樣可避免紫外線切割，從而提高長片段PCR克隆效率。

有文獻報告在構建HIV 感染性分子克隆時最好選擇低拷貝數的質粒載體[22],這是因為HIV 全長cDNA 兩端具有同向的長末端重復序列,在復制過程中容易發生同源重組,并導致內含子的缺失,外源片段的插入,影響質粒的穩定性。此外,還應盡量采用缺失重組基因[ recA (-) ]的宿主菌[23]。但值得注意的是,最早的感染性克隆pNL4-3 即是用高拷貝的pUC18 質粒構建而成,至今仍然被廣泛使用[24]。本文所用的質粒構建載體是采用pCR-XL-TOPO也是用高拷貝的pUC載體系列，而在一年多時間應用過程中尚未發現上述不穩定因素，當然這還需要今后更長時間的實驗驗證其可行性。

HIV-1高度的遺傳多樣性，以及HIV-1復制過程中的高突變率、重組率和出錯率造成體內大量HIV準種的存在，這樣導致從前病毒基因組模板中擴增獲得的序列必然呈現多樣性。本實驗構建的12株全基因組克隆中僅有2株呈現強感染性，其余為無感染性或感染性不強。這可能是HIV在體內復制過程中由于基因突變或缺失而導致其復制缺陷。值得關注的是，其中有兩株全基因組克隆（plwj2+6和plwj5+6）各自轉染上清感染PBMCs細胞時感染性很低或呈弱陽性，但當這兩株克隆質粒共轉染293T細胞所產生的混合衍生病毒感染PBMCs細胞時則表現出強陽性，這預示著這兩株克隆由于基因變異使得在復制過程中產生缺陷病毒，但這兩株缺陷病毒在功能上卻能夠進行互補，從而產生有感染性的衍生病毒。

plwj全基因組序列分析結果顯示plwj克隆株為Thai-B亞型，該毒株雖然來自福建但它可能與河南有償獻血人群中流行的Thai-B亞型毒株02HNsc11、02HNsq4、02HNsmx2及CNHN24有共同的病毒起源，這與感染者自稱其是經輸血感染HIV事實相吻合。序列耐藥分析發現plwj沒有導致現有抗病毒治療藥物（ARV）的耐藥突變，對ARV藥物依然敏感。這與樣品采自中國開始大規模免費ARV治療之前的時間相一致。

該株感染性克隆的成功構建將為我省HIV-1病毒的生物學和免疫學特性研究提供有效的工具，為探討我國主要HIV-1 流行毒株（Thai-B 、CRF07_BC、CRF08_BC）的致病機理奠定基礎，同時也為抗HIV-1疫苗和藥物的研究和評估及耐藥性檢測方面提供重要的工具。

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