海南粗榧內生真菌S15的細胞毒活性產物

黃玖利,戴好富,王 輝,郁 蕾,梅文莉

(中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所農業部熱帶作物生物技術重點開放實驗室,海南海口 571101)

海南粗榧(Cephalotaxus hainanensisLi)為三尖杉科(Cephalotaxaceae)三尖杉屬(Cephalotaxus)植物[1]。該植物因含有已被開發成治療白血病的臨床藥物高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿而倍受關注[2]。但因其生長緩慢,加之過度采伐,目前數量稀少,已被列為國家二級保護植物。近年來,植物內生菌研究的迅速發展不僅使人們認清內生真菌在生態系統中的重要地位,更讓人們認識到它是一種重要的藥用生物資源。前人已從植物內生真菌中分離得到生物堿、甾體、萜類、醌類和木脂素等多種類型化合物,并多具有抗腫瘤、抗菌、促進宿主植物生長、生物防治等生物活性,在醫藥業和農業中有巨大的應用潛力。本研究組從海南粗榧韌皮部分離出S15菌株,在生物活性篩選過程中,發現其發酵液提取物對胃癌細胞顯示出強細胞毒活性[3]。對該菌株擴大發酵,從其代謝產物中分離得到2個具有細胞毒活性的化合物,通過波譜方法鑒定其結構為去乙酰基細胞松弛素D(Zygosporin D,1)和細胞松弛素D(Cytochalasin D,2)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 內生真菌 菌種S15分離自海南粗榧韌皮部,暫被歸為無孢菌群[4],菌種保藏于中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所。

1.1.2 腫瘤細胞株 MMC-7721(人肝癌細胞)、SGC-7901(人胃癌細胞)和K562(慢性髓原白血病細胞)均購于中科院上海生命科學研究院細胞庫。

1.1.3 臨床病原菌 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 51650、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)ATCC 9551由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所洪葵教授提供。

1.1.4 培養基 ①馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,定容至1 L,pH自然;②馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,定容至1 L,pH自然;③燕麥培養基：燕麥片30 g,瓊脂20 g,定容至1 L,pH自然;④玉米培養基：玉米粉300 g,瓊脂20 g,定容至1 L,pH自然;⑤牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基(NA)：牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,定容至1 L,pH 7.4～7.6;⑥腫瘤細胞株采用RPM I1640完全培養基。

1.1.5 試劑 乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮、石油醚,均為分析純;碘化鉍鉀、硅膠、GF254薄層層析板和柱層析、200-300目硅膠(青島海洋化工廠)、Sephadex LH-20(Merck公司)。

1.1.6 儀器 重慶光電BK2301顯微鏡,Heidolph Laborota-20L旋轉蒸發儀,Bruker AV-400核磁共振波譜儀(T MS內標),Autospec-300質譜儀。

1.2 方法

1.2.1 菌株S15形態觀察 將斜面保存的菌株S15經PDA培養基活化,用滅菌打孔器(Φ=4.5 mm)取菌齡一致的菌絲塊,接種在PDA培養基平板中央,置于25℃恒溫箱中培養,培養7 d后,測量并記錄直徑。將菌絲塊接種在PDA、燕麥、玉米培養基上,14 d后觀察產孢情況。

1.2.2 提取與分離 將斜面保存的菌株S15經PDA培養基活化后接種于30 L PDB培養基中,25℃靜置培養30 d。發酵產物用雙層紗布過濾,發酵液經減壓濃縮至2 L,用乙酸乙酯萃取3次,萃取液減壓濃縮后得乙酸乙酯萃取物9.5 g。乙酸乙酯萃取物經硅膠柱色譜以氯仿-甲醇(體積比20：1和10：1)梯度洗脫得14個流分(Fr.1～Fr.14),Fr.8經Sephadex LH-20柱色譜以氯仿-甲醇(體積比1：1)洗脫得化合物1(830 mg),Fr.9經硅膠柱色譜以石油醚-丙酮(5：1)洗脫后再經Sephadex LH-20柱色譜以氯仿-甲醇(體積比1：1)洗脫得化合物2(26 mg)。

1.2.3 結構鑒定 所分離到的純化合物用Autospec-300質譜儀測定分子量,用BrukerAV-400核磁共振波譜儀(T MS內標)測定NMR數據。

1.2.4 化合物活性測試 ①抗腫瘤活性測定：以S MMC-7721、SGC-7901和K562細胞為指示瘤株,待測化合物1 mg溶于100μL DMSO,采用MTT[5]法測定體外細胞毒活性。選取對數生長期的細胞,用RPM I1640完全培養基制成單細胞懸浮液,血球計數板計數,按50 000個/mL接種90 μL于96孔平底細胞培養板,K562中直接加樣品10μL,S MMC-7721和SGC-7901經培養24 h后,再加入樣品10μL;以DMSO為陰性對照,絲裂霉素C為陽性對照,培養條件為5%CO2、濕度90%以上、溫度37℃,加入樣品后繼續培養72 h,完成培養后取出,置于顯微鏡下觀察每孔細胞形態。然后加入5 mg/mL的MTT溶液15μL,37℃反應4 h后,吸棄上清,再向各孔加入100μL DMSO,充分溶解,用ELX-800酶標儀測量各孔的OD值(測量波長為490 nm),按下式計算抑制率,并求出I C50值。

②抗臨床病原菌活性測定：采用濾紙片法[6]測定樣品抗菌活性。S.aureus和MRSA采用NA培養基培養。將S.aureus和MRSA分別制成一定濃度的菌懸液(105～107cfu/mL),用棉簽將其均勻涂布于供試無菌平板,制成含菌平板,待測化合物和陽性對照卡拉霉素濃度均為20μg/μL,待試樣品25μL用滅菌濾紙片(Φ=8 mm)吸附后揮干,制成含樣濾紙片,每個平板放置4個,每處理重復3次,空白濾紙片為陰性對照,S.aureus和MRSA 37℃恒溫培養24 h后觀察結果,測量并記錄抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 菌株S15形態觀察

S15菌落白色,疏松,表面絨毛狀,與培養基結合較緊密,在PDA培養基上25℃生長7 d后平均直徑為42.7 mm。菌絲無色,長短、粗細不等,單個或數個相連,菌絲不分枝。壁平直、直徑約為3～7μm。部分菌絲較細,直徑約為1.5～3.5 μm,彎曲。在PDA、燕麥、玉米培養基上均不產孢。

圖1 S15的菌落形態Fig.1 The colony of S15

圖2 S15的菌絲形態(400×)Fig.2 The mycelia of S15(400×)

2.2 化合物結構鑒定

2.2.1 化合物1 白色晶體(丙酮),體積分數10%的硫酸顯棕黃色。碘化鉍鉀顯色呈橙黃色,推測其為生物堿或含有N原子。EI-MS∶m/z 465[M]+,結合13C NMR(DEPT)譜和1H NMR譜推定其分子式為C28H35NO5。1H NMR譜部分數據見表1,13C NMR譜數據見表2。

表1 化合物1(400 M Hz,Acetone-d6)和2的氫譜數據(400 M Hz,CDCl3)Table 1 1H NMR spectral data for compounds 1(400 MHz,Acetone-d6)and 2(400 MHz,CDCl3)

化合物1的各種波譜數據與文獻[7]報道的去乙酰基細胞松弛素D(Zygosporin D)的數據比較基本一致,基于上述分析,鑒定該化合物為去乙酰基細胞松弛素D(Zygosporin D),其結構式見圖3。

2.2.2 化合物2 白色晶體(氯仿),體積分數10%的硫酸顯棕黃色,碘化鉍鉀顯色呈橙黃色,推測其為生物堿或含有N原子。EI-MS：m/z507[M]+,結合13C NMR(DEPT)譜和1H NMR譜推定其分子式為C30H37NO6。1H NMR譜部分數據見表1,13C NMR譜數據見表2。該化合物各種波譜數據與文獻[8]報道的細胞松弛素D的數據比較基本一致,基于上述分析,鑒定該化合物為細胞松弛素D(Cytochalasin D),其結構式見圖3。

圖3 化合物1和2的結構Fig.3 Structures of compounds 1 and 2

表2 化合物1(100 M Hz,Acetone-d6)和2的碳譜數據(100 M Hz,CDCl3)Table 2 13C NMR spectral data of compounds 1(100 MHz,Acetone-d6)and 2(100 MHz,CDCl3)

2.3 生物活性測試

2.3.1 抗腫瘤活性測試 采用MTT法對2個化合物的抗腫瘤活性進行測試,結果顯示2種細胞松弛素對K562、S MMC-7721無細胞毒活性,對SGC-7901有細胞毒活性,其I C50值見表3。

2.3.2 抗臨床病原菌活性測定 采用濾紙片法測定了2種化合物抗臨床病原菌活性,結果表明2種細胞松弛素對S.aureus和MRSA均無抑菌活性。

表3 化合物1和2的細胞毒活性Table 3 The cytotoxic activities of compounds 1 and 2

3 討 論

細胞松弛素類化合物是一類由真菌代謝產生的毒素,已從長蠕孢屬(Helm inthosporiumsp.)、座堅殼屬(Roselliniasp.)、曲霉屬(Aspergillus sp.)、基點屬(Phom asp.)、擬莖點霉屬(Phom opsissp.)、毛殼菌屬[9](Chaetom iumsp.)、肉球菌屬[8](Englerom ycessp.)、接菌孢屬[10](Zygosporiumsp.)、綠僵菌屬[11](M etarrhiziumsp.)、鹿角菌屬[12](Xylariasp.)、炭團菌屬[13](Hypoxylon sp.)、輪層炭殼屬[14](Daldiniasp.)、鞘孢屬[15](Chalarasp.)和絲核菌屬[16](Rhizoctoniasp.)等真菌中分離得到,它們中有一些具有顯著的生物學活性,如抑制哺乳動物細胞分裂、抑制H IV-1蛋白酶、抗菌和抗腫瘤等活性。細胞松弛素因為具有改變細胞微結構的作用,因此成為細胞生物學中細胞微結構和功能研究的常用工具,用于探討細胞分裂、細胞運動和吞噬、細胞核和質的關系和細胞生物合成等生命活動。

細胞松弛素D最早由英國學者Aldridge等于1969年從綠僵菌屬(M etarrhiziumsp.)分離得到并鑒定,后又從肉球菌屬(Englerom ycessp.)及鹿角菌屬(Xylariasp.)分離得到。去乙酰基細胞松弛素D最早由日本學者Minato于1970年從接柄孢屬(Zygosporiumsp.)分離得到并鑒定,后又分別從肉球菌屬(Englerom ycessp.)及綠僵菌屬(M etarrhiziumsp.)分離得到。本研究從海南粗榧內生真菌S15中同時分離得到細胞松弛素D和去乙酰基細胞松弛素D,2種細胞松弛素對人胃癌細胞(SGC-7901)均有強細胞毒活性,其作用機理還有待進一步研究,但2種細胞松弛素對臨床病原細菌S.aureus和MRSA的生長均無抑制作用。

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