多重PCR方法快速檢測4種主要致腹瀉性大腸埃希菌

徐義剛,崔麗春,李蘇龍,姜艷春,謝曉峰,劉新亮

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,黑龍江哈爾濱 150001;2.東北林業大學,黑龍江哈爾濱 150040)

大腸埃希菌(Escherichia coli)由Escherich于1885年首次發現,起初一直被認為是腸道菌群的正常組成部分,屬于條件致病菌。20世紀中葉,人們認識到某些特殊血清型大腸埃希菌對人和動物有致病性,尤其對嬰兒和幼畜(禽),常引起嚴重腹瀉和敗血癥[1-2]。與人類疾病有關的大腸埃希菌,統稱為致瀉性大腸埃希菌(diarrheogenicE.coli),根據生物學特性主要分為4類[3-4]：產腸毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和腸出血性大腸埃希菌(EHEC)。致瀉性大腸埃希菌作為人畜共患性致病菌,其研究具有重要的公共衛生意義。ETEC主要感染兒童和旅游者,發展中國家尤為嚴重,被污染的水和食物是主要傳染來源,主要致病因素是大腸埃希菌腸毒素LT或ST[5],感染的臨床癥狀輕度時為溫和性腹瀉,嚴重時可發展為霍亂樣腹瀉癥狀[6];EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原菌,具有高度傳染性,嚴重者可致死,病原菌主要感染腸上皮細胞或組織培養細胞表面形成特征性的組織病理學損傷[7];EIEC主要引起大齡兒童和成年人腹瀉,曾爆發流行,臨床癥狀為水樣腹瀉,有時呈現痢疾癥狀[8];EHEC主要血清型是O157：H7,引起散發性或暴發性出血性結腸炎,可產生志賀毒素樣細胞毒素[9]。目前我國針對致瀉性大腸埃希菌的檢測方法主要采用國標法(GB 4789.6-1994),經樣品→增菌→分離培養→革蘭染色鏡檢/生化及菌落觀察/生化反應試驗/腸毒素檢查等,操作復雜繁瑣,檢測時間長,完成整個檢測程序需要4～7 d,且檢測單一。本文結合致瀉性大腸埃希菌的危害性和感染的普遍性,建立一種多重PCR方法,實現一次性完成4種主要致瀉性大腸埃希菌的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸埃希菌ATCC 25922、腸出血性大腸埃希菌O157：H7 ATCC 35150、產腸毒素大腸埃希菌ATCC 35401、侵襲性大腸埃希菌ATCC 43893、腸致病性大腸埃希菌ATCC 11775、阪崎腸桿菌ATCC 51329、單核細胞增生李斯特菌ATCC 19111、綿羊李斯特菌ATCC 33090、英諾克李斯特菌ATCC 19119、威爾斯李斯特菌ATCC 35897、西爾李斯特菌ATCC 35967、類志賀單胞菌ATCC 14030、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、空腸彎曲菌ATCC 33560、普通變形桿菌ATCC 49027、豬霍亂沙門菌ATCC 10708、福氏志賀菌ATCC 12022、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、溶血性鏈球菌CMCC 32121、霍亂弧菌ATCC 14035、副溶血性弧菌ATCC 27519、溶藻性弧菌ATCC 33839、創傷弧菌ATCC 33149和小腸結腸炎耶爾森菌ATCC 9610,分別由美國典型菌種保藏中心(ATCC)和中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)提供。

1.1.2 試劑 TaqDNA Polymerase,NEB公司;細菌基因組DNA提取試劑盒,大連TaKaRa公司;復合增菌培養基BPW,北京蘭伯瑞生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank中發布的EHEC O157：H7 O-antigen基因、ETEC LT基因、EPECbfpA基因和EIEC invasion plas mid基因,利用引物設計軟件Pr imer 5.0設計4對多重PCR引物,詳細信息見表1,引物由大連TaKaRa公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 The primers sequence of PCR

1.2.2 細菌培養及基因組DNA提取 將試驗菌株分別接種于5 mL復合增菌培養基BPW中,按照每種細菌最適生長溫度培養過夜,吸取1 mL培養菌液,利用細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取DNA,詳見說明書。

1.2.3 單一PCR反應體系及條件的優化 PCR反應體系為25μL,不含Mg2+的Buffer(10×)2.5 μL,將Mg2+、dNTP、TaqDNA Polymerase和引物配制成不同濃度的組合,用去離子水補充至25μL。Mg2+、dNTP、TaqDNA Polymerase和引物的濃度范圍依次為：Mg2+濃度范圍1.0～8 mmol/L,以0.5 mmol/L遞增;dNTPs濃度范圍0.1～0.8 mmol/L,以0.05 mmol/L遞增;TaqDNA Polymerase濃度范圍0.5～3.5 U,以0.5 U單位遞增;引物濃度范圍0.1～0.6μmol/L,以0.1μmol/L遞增。采用矩陣法進行對比試驗。反應條件：95℃5 min,95℃20 s,為了提高PCR反應的靈敏度和特異性,根據設計的引物退火溫度,以55℃為基礎,以0.5℃遞加,直至62℃,時間30 s,進行35個循環。

1.2.4 多重PCR反應條件的優化 多重PCR反應體系為25μL,以提取的致病菌基因組作為模板,進行多重PCR擴增,反應條件及體系優化參考單重PCR方法進行。

1.2.5 多重PCR方法的特異性 采用試劑盒法提取試驗菌株的基因組DNA,利用所建立的多重PCR方法進行擴增,驗證本方法的特異性。

1.2.6 多重PCR方法的敏感性 測定所提取的4種致瀉性大腸埃希菌基因組DNA濃度,然后分別進行10倍遞進系列稀釋,從每種致病菌基因組DNA的每個稀釋度中各取1μL混合,以此作為模板進行多重PCR擴增,以確定其敏感性。

1.2.7 驗證試驗 將建立的多重PCR檢測方法應用于檢驗檢疫實踐工作中,檢測124份肉類、奶類制品及人工污染樣品等,其結果與國標法(GB 4789.6-1994)進行比較,驗證該方法的可靠性。

2 結果與分析

2.1 多重PCR反應條件的確定

首先對單一PCR反應體系進行了優化,經對比分析確定單一PCR反應體系中的Mg2+濃度為2.5 mmol/L、dNTP濃度為0.2 mmol/L、TaqDNA Polymerase用量為1.5 U、引物濃度為0.2μmol/L,在該反應體系下的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果見圖1。在單一PCR反應體系擴增的基礎上,優化了多重PCR反應體系及條件,最佳反應體系為：Mg2+濃度為4 mmol/L、dNTP濃度為0.3 mmol/L、TaqDNA Polymerase用量為2.0 U,PCR擴增引物濃度比例為ETEC：EHEC：EIEC：EPEC=1：1：1.3：1。反應條件為：95℃5 min、95℃15 s、60℃20 s、72℃60 s,進行35個循環,多重PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖2。

圖1 致瀉性大腸埃希菌單一PCR檢測結果Fig.1 The detection results of diarrheogenicEscherichia coliby single PCR

圖2 4種致瀉性大腸埃希菌多重PCR擴增結果Fig.2 The amplification results of four diarrheogenic Escherichia colibymulti-PCR

2.2 多重PCR的特異性

利用多重PCR方法對表2中24株細菌進行特異性檢測試驗,結果顯示所試腸出血性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌、腸致病性大腸埃希菌和產腸毒性大腸埃希菌等4種致瀉性大腸埃希菌均為陽性,說明本研究所建立的多重PCR方法具有高度特異性。

表2 多重PCR特異性結果Table 2 The specificity results ofmulti-PCR assay

2.3 多重PCR的敏感性

將已知濃度的4種致瀉性大腸埃希菌基因組DNA進行梯度稀釋,從每個稀釋度中各取1μL混合,以此作為模板進行多重PCR擴增,以確定其敏感性。結果表明,該多重PCR方法能同時檢測到128 pg的EHEC、EPEC、EIEC和ETEC的基因組DNA,其中EHEC和ETEC的最低基因組DNA檢出濃度為32 pg。

2.4 多重PCR的實踐應用

利用多重PCR方法對124份肉類、奶類制品及人工污染食品樣品進行檢測,同時采用國標進行驗證,結果見表3。多重PCR方法共檢出15份陽性樣本,與國標檢測結果符合率為100%,說明所建立的多重PCR方法具有良好的可靠性。

表3 多重PCR方法實際應用結果Table 3 The application ofmulti-PCR assay in practice

3 討 論

食品安全是全球性的重大公共衛生問題,已報道的食源性疾病致病因子有250多種,其中腸道致病菌是食源性疾病中最常見的生物致病因素。據世界衛生組織(WHO)報道[10],全球每年因食源性微生物污染引起的腹瀉病例達數億起,死亡的0～15歲兒童約170萬人。目前,致瀉性大腸埃希菌仍是引起腹瀉的重要病原之一,特別是嬰幼兒腹瀉,在我國及國外腹瀉患者中致瀉性大腸埃希菌檢出率、構成比、優勢類型及血清型不同[11-15],給臨床診斷帶來不便。

在此情況下,采用多重PCR方法一次性檢測出單一病原感染或混合感染,對保障食品安全和人類健康具有現實意義。因此,本研究針對4種主要的致瀉性大腸埃希菌相關基因設計了4對特異性引物,通過體系及反應條件優化,建立了一步反應同時檢測4種致瀉性大腸埃希菌的多重PCR方法。檢驗檢疫實踐證實,該方法比常規的細菌分離鑒定敏感度高,檢測快速,可用于臨床病例的快速診斷和流行病學調查,具有一定的實用性。

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