Eremomycin的發酵條件優化及發酵產物的分離純化

尹明明,陳代杰,張怡軒＊,阮林高＊

(1.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院,遼寧沈陽 100016;2.上海來益生物藥物研發中心,上海 200240)

大多數手性藥物的分析是通過高效液相色譜來完成的,因此手性固定相的選擇至關重要。自從1994年Ar mstrong等[1]首次將糖肽類抗生素作為手性選擇劑應用于高效液相色譜手性固定相并獲得成功以來,萬古霉素(vancomycin)[2]、替考拉寧(teicoplain)[3]、瑞斯托菌素A(ristocetin A)[4]、去甲萬古霉素(norvancomycin)[5]等大環糖肽類抗生素相繼被作為液相色譜的手性固定相。2006年,Staroverov教授[6]利用糖肽類抗生素eremomycin合成了一種新的手性固定相,并在高效液相色譜中用來分離19種手性藥物,其中12種獲得分離。之后的研究證明,eremomycin作為手性固定相能很好地分離天然氨基酸尤其是芳香類氨基酸[7-8]。東方諾卡菌(Nocardia orientalis)NRRL 18098產生3種結構相似的糖肽類抗生素,分別為A82846A、A82846B和A82846C,其中A82846A又稱作eremomycin,其化學結構在上世紀80年代得到確證[9-10],化學結構式如圖1所示。由于東方諾卡菌NRRL 18098發酵生產A82846抗生素的發酵產量均較低,因此選擇合適發酵條件,提高eremomycin的發酵單位是大量制備并降低其成本的關鍵。本實驗考察了培養基組成和發酵條件對eremomycin發酵的影響,以期得到發酵eremomycin的最佳工藝條件,并利用樹脂吸附、中壓液相色譜技術相結合的方法分離得到高純度的eremomycin。

圖1 Eremomycin的化學結構Fig.1 Chemicial structure of eremomycin

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 東方諾卡菌(Nocardia orientalis)NRRL 18098,上海來益生物藥物研發中心保藏。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀:Agilent1100-DAD(安捷倫科技有限公司);色譜柱:Agilent Zorbax-SB-C18(4.6 mm×150 mm,5μm)(安捷倫科技有限公司);中壓層析色譜柱:Unips 25-300(蘇州納微生物科技有限公司);大孔離子交換樹脂001×4(上海華震科技有限公司);大孔吸附樹脂1600(美國羅門哈斯公司);254 nm紫外吸收檢測儀(上海金達生化儀器有限公司)。Agilent液質聯用色譜儀:含6110型單四極桿質譜儀,配有大氣壓電離-電噴霧電離源(API-ES)和大氣壓化學電離源(APCI),含Agilent-1100系列四元泵、VWD檢測器、Agilent Chemstation色譜工作站,(美國Agilent公司)。

1.1.3 試劑 本實驗所用試劑純度均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵及發酵液預處理 ①斜面培養基(g/L):葡萄糖10,可溶性淀粉20,酵母浸出粉5,酪蛋白水解物5,碳酸鈣1,瓊脂粉25。消前pH 7.5。培養條件:30℃恒溫培養培養120 h;②種子培養基(g/L):可溶性淀粉1,酵母浸出粉5,酪蛋白水解物5,碳酸鈣1。消前pH 7.5。培養條件:30℃,搖床轉速250 r/min、培養72 h;③發酵基礎培養基(g/L):葡萄糖25,糊精30,蔗糖2,玉米漿粉1,黃豆餅粉15,酪蛋白水解物5,碳酸鈣2.5。消前pH 7.5。培養條件:30℃,搖床轉速250 r/min、培養120 h。本試驗采用500 mL的搖瓶以15%(體積比)裝量發酵,發酵結束用4 mol/L鹽酸酸化發酵液,調pH至4.5離心收集上清,供HPLC分析及后續分離純化用。

1.2.2 Eremomycin含量檢測 用HPLC法檢測eremomycin含量。流動相:A=0.1%三氟乙酸水溶液(體積比),B=乙腈。梯度洗脫程序:0～20 min,A∶B(95∶5)(體積比)～A∶B(85∶15)(體積比);20～30 min,A∶B(85∶15)(體積比)～A∶B(40∶60)(體積比)。流速:1.0 mL/min。紫外檢測:240 nm。柱溫:30℃。

1.2.3 Eremomycin的分離純化方法 大孔吸附樹脂001×4預處理后,每1 g樹脂中加入20 mL發酵液置于磁力攪拌器上攪拌2 h除色素,然后以流速1.5 mL/min流入填好的經過預處理的大孔吸附樹脂1600玻璃層析柱中,用乙醇∶0.05%(質量分數)鹽酸水溶液(體積比0∶100)～乙醇∶0.05%(質量分數)鹽酸水溶液(體積比15∶85)梯度洗脫。HPLC法檢測流分的組成及目標產物濃度,合并、納濾膜過濾去除小分子、濃縮含有目標組分的溶液。取經樹脂分離后濃縮樣品80～100 mg,溶于10 mL無水甲醇中。過Unips 25-300中壓柱,用甲醇∶0.005%(質量分數)鹽酸水溶液(體積比1∶99)～甲醇∶0.005%(質量分數)鹽酸水溶液(體積比20∶80)梯度洗脫,254 nm檢測,分步收集有紫外吸收部分洗脫液(10 mL/瓶),HPLC測定洗脫液中各組分的組成及濃度,合并含有目的組分的溶液,減壓濃縮。

1.2.4 Eremomycin質譜分析 質譜條件:離子源為大氣壓電離源(APCI)的,霧化氣壓力為0.41 MPa,干燥氣溫度為350℃,干燥氣流速6 L/min,蒸發室氣化溫度350℃,毛細管電壓2 000 V,電流4μA,正離子方式檢測。

2 結 果

2.1 自然分離

以東方諾卡菌NRRL 18098為出發菌種,經自然分離純化處理后,再經搖瓶初篩、復篩獲得較高效價菌株Y311,其發酵單位為70.3 mg/L,確定為本實驗發酵用出發菌株。

2.2 種齡

取100μL菌株Y311孢子液(>108個/mL)接種至種子培養基中,30℃振蕩(250 r/min)培養2～7 d,觀察菌絲體的生長情況。將種齡分別為2、3、4、5、6 d的種子液按照1%(體積比)接種至搖瓶發酵培養基中,繼續培養4 d。以4 d種齡所得效價為對照,發酵結果見圖2。由圖2可知,種齡為3 d和4 d時,eremomycin發酵產量迅速提高,但當種齡延長到5 d或者更長時間,均不利于eremomycin的生物合成。綜合考慮菌絲量,確定種齡為4 d比較適宜。

圖2 種齡對eremomyc in產量的影響Fig.2 Effect of seeds ages on the production of eremomycin

2.3 復合碳源對eremomycin發酵的影響

將4 d種子液按照1%的接種量接種至含不同的復合碳源組成的發酵培養基中,于30℃、250 r/min振蕩培養4 d。以第1組為對照,發酵結果見表1。實驗結果表明,4號實驗組(復合碳源為葡萄糖2.5%、糊精3.0%、蔗糖0.3%)的eremomycin發酵效價最高,比較各組碳源組成,葡萄糖和蔗糖可能有利于效價的提高。

2.4 復合氮源對eremomycin發酵的影響

將4 d的種子培養液按照1%的接種量接種至含不同復合氮源的發酵培養基中,于30℃振蕩、250 r/min培養4 d。以第8組為對照,試驗結果見表2。

表1 不同碳源對eremomycin產量的影響Table 1 Effect of different carbon sources on the production of eremomycin

表2 不同氮源對eremomycin產量的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on the production of eremomycin

實驗結果表明,11號實驗組(復合氮源為黃豆餅粉1.5%、蛋白胨0.5%)的eremomycin發酵效價最高,比較各組氮源組成,黃豆餅粉和蛋白胨可能有利于效價的提高。

2.5 培養基優化

考慮到發酵成本以及產物分離提取的便利,利用L9(34)正交表設計試驗,其他成分不變,考察蛋白胨、葡萄糖、糊精和蔗糖對eremomycin產量的影響,實驗結果及極差分析見表3。

表3 正交實驗的結果Table 3 The result of orthogonal experiment

試驗結果表明,蛋白胨的極差最大,其次是葡萄糖和糊精,蔗糖極差最小,因此各因素對產量影響的順序為:A>B>D>C。4種因素最佳組合(質量分數,%)為蛋白胨1.5、葡萄糖2.5、糊精3.0、蔗糖0.2。該組合不在正交實驗表中,所以按照培養基組成(質量分數,%)為葡萄糖2.5、糊精3.0、蔗糖0.2、黃豆餅粉1.5、蛋白胨1.5、碳酸鈣0.25驗證試驗,發酵效價為115 mg/L,高于107 mg/L,說明正交實驗取得成功,比優化前發酵效價提高了63.5%。

2.6 Eremomycin的分離純化與鑒定

實驗證明,在大孔吸附樹脂1600柱層析過程中,用0.05%(質量分數,%)鹽酸水溶液(體積比)～乙醇∶0.05%(質量分數,%)鹽酸水溶液(體積比15∶85)梯度洗脫,目標組分eremomycin集中于乙醇∶0.05%(質量分數,%)鹽酸水溶液(體積比5∶95)的洗脫流分中。在Unips25-300中壓柱層析過程中,當梯度洗脫液濃度為甲醇∶0.005%(質量分數,%)鹽酸水溶液(4∶96,體積比)時,eremomycin流出,其純度經HPLC法檢測達到93%(圖3)。

收集此梯度下洗脫液,調至中性,再經過脫鹽、減壓濃縮即能得到精制品,其純度經HPLC法檢測達到97%(圖4)。

取自制精制品進行檢測其質譜(圖5),主要峰值與文獻[10]中的鑒別峰數據均一致(表4),說明獲得的純品確實為eremomycin。

圖3 Un ips25-300中壓樹脂洗脫后的含eremomyc in的流份HPLC圖譜Fig.3 HPLC analysis of eremomycin afterUnips25-300 medium pressure liquid chromatography

圖4 純化后的eremomycin的HPLC圖譜Fig.4 HPLC analysis of purified eremomycin

圖5 Eremomycin的質譜Fig.5 The mass spectrum of eremomycin

表4 對eremomycin的質譜和文獻報道解析的對比Table 4 Mass spectrum comparision of reference eremomycin and purified eremomycin

3 討 論

正交實驗法是利用排列整齊的正交表來對試驗進行整體設計、綜合比較、統計分析,實現通過少數的實驗次數找到較好的生產條件,以獲得最佳生產工藝。本實驗通過正交設計確定了對eremomycin發酵水平貢獻度大的各種碳、氮源種類和最佳濃度,獲得的最佳培養基配方使eremomycind的發酵水平顯著提高了63.5%,說明發酵配方的優化對提高抗生素產量至關重要,而且正交設計法是一種快速、效果顯著的優化培養基的方法。

東方諾卡菌(Nocardiaorientalis)NRRL 18098產生3種結構相似的糖肽類抗生素,分別為A82846A(eremomycin)、A82846B和A82846C。由于它們結構的相似性,導致這3種組分很難分離。本實驗在樹脂吸附洗脫的基礎上,首次將中壓液相層析技術引入eremomycin的分離過程中,獲得了純品,方法簡便、快速,為今后更好地分離A82846抗生素的3種組分進行了有益的探索。

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