Genome shuffling在釀酒酵母菌種選育中的應(yīng)用

孫紅兵,宋 剛,平文祥,葛菁萍

(黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150080)

由于全球可用化石能源的急劇減少以及人類對環(huán)境的日益關(guān)注,用生物能源替代部分化石能源已經(jīng)成為一種重要的可再生能源途徑。釀酒酵母(Saccharom yces cerevisiae)是傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)菌,但其發(fā)酵性狀均是由多基因控制的復(fù)雜表型。根據(jù)近年來在表型及蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究進(jìn)展[1],推測釀酒酵母中對乙醇耐受性的基因至少有250個,同時(shí)涉及到大量的基因產(chǎn)物及相關(guān)的代謝途徑,在乙醇對酵母細(xì)胞作用機(jī)制完全闡明以前,很難采用定向育種、代謝工程或者其他基因工程手段對其進(jìn)行改造。因此,應(yīng)用Genome shuffling對釀酒酵母進(jìn)行改造將會是一種行之有效的方法,尤其是那些具有實(shí)際利用價(jià)值的工業(yè)酵母。Genome shuffling首先是由Stemmer研究小組于1998年提出來的,被譽(yù)為菌種表型改進(jìn)及代謝工程中的一個里程碑事件,Genome shuffling作為一種有效的全細(xì)胞工程手段已經(jīng)被成功地應(yīng)用在許多重要的工業(yè)微生物領(lǐng)域[2]。

1 從原生質(zhì)體融合到Genome shuffling

Genome shuffling是源于原生質(zhì)體融合的一種技術(shù)。原生質(zhì)體融合技術(shù)是始于20世紀(jì)70年代中后期發(fā)展起來的一種用于細(xì)胞表型改進(jìn)的方法,但兩者最大的區(qū)別在于Genomeshuffling使用多親本而非雙親本,并且進(jìn)行遞推式循環(huán)原生質(zhì)體融合,這相對于經(jīng)典的誘變育種而言[3],在工作量沒有增加的前提下,Genome shuffling將大大增加子代篩選群體內(nèi)的遺傳多樣性,從而提高獲得優(yōu)良性狀菌株的幾率,見圖1。

2 Genome shuffling的技術(shù)過程

成功的Genome shuffling取決于突變體文庫的構(gòu)建的可靠性、基因重組的效率以及篩選方法的有效性,見圖2。

2.1 突變體文庫的構(gòu)建

Genome shuffling的第一步是選擇原始菌株,然后構(gòu)建突變體候選株文庫,以這些表型提高的菌株作為Genome shuffling的對象[4]。在構(gòu)建突變體文庫時(shí),一般都會選用多種經(jīng)典的誘變育種方法對原始菌株進(jìn)行改進(jìn)以產(chǎn)生遺傳表型的改變,在對有益表型進(jìn)行選擇時(shí),目前選擇標(biāo)準(zhǔn)均聚焦在產(chǎn)量或者是對環(huán)境耐受性提高等方面,但除此以外,菌株的生長特性也應(yīng)該是值得關(guān)注的一個方面,因?yàn)榫戤a(chǎn)量或者是對環(huán)境耐受性的提高往往伴隨著對生長的不利[2],所以,在突變體文庫中最好留有野生型的親本菌株以提高子代的生長性能。

2.2 遞推式循環(huán)原生質(zhì)體融合

Genome shuffling采用多親本遞推式循環(huán)原生質(zhì)體融合技術(shù)對微生物整套基因組進(jìn)行重排,遞推式循環(huán)原生質(zhì)體融合產(chǎn)生同源重組的幾率要比常規(guī)原生質(zhì)體融合高得多,能產(chǎn)生各種各樣的突變組合,從而達(dá)到快速進(jìn)化微生物表型的目的[5]。

2.3 選擇理想表型

在Genome shuffling的整個進(jìn)程中,選擇有效的方法對遞推式循環(huán)原生質(zhì)體融合的子代進(jìn)行篩選是最為關(guān)鍵也是最困難的一步。對于篩選產(chǎn)酶菌株產(chǎn)量是否提高經(jīng)常通過生理生化特征來鑒定,比如說,可以在瓊脂平板上檢測其水解圈、透明圈及抑菌圈的大小[2],這種方法比較直觀,效果也較好,但是對于其他菌株的篩選鑒定就顯得較為困難。

3 Genome shuffling在釀酒酵母中的應(yīng)用

Genome shuffling是一種新型而又富有生命力的技術(shù),對釀酒酵母而言,現(xiàn)在主要應(yīng)用于產(chǎn)量的提高及表型的改進(jìn)[6],主要表現(xiàn)在乙醇產(chǎn)量的提高、對周圍環(huán)境耐受性的增強(qiáng)以及改進(jìn)其他性狀。

3.1 提高乙醇的產(chǎn)量

在提高釀酒酵母代謝產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)量研究上,2008年,有學(xué)者[7]對篩選得到的5株酵母菌ES-1、ES-2、ES-3、ES-4和ES-5(乙醇產(chǎn)量分別為40、51、63、68和70 g/L),以它們?yōu)槌霭l(fā)菌株,通過原生質(zhì)體誘變,進(jìn)行5輪的Genome shuffling,最終獲得融合菌株GS4-185,其乙醇產(chǎn)量可以達(dá)到142 g/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于親本的乙醇產(chǎn)量。2009年,Hou Lihua[1]利用一種新型的Genome shuffling對工業(yè)釀酒酵母WT首先進(jìn)行硫酸二乙酯的誘變,以篩選得到的菌株作為出發(fā)菌株,通過3輪的Genome shuffling,從高乙醇濃度的特殊平板上獲得菌株S3-10,該菌株顯示了對乙醇、葡萄糖及熱的多重抗性,其乙醇的產(chǎn)量相對于高密度(VHG)發(fā)酵來說,提高到10.96%,發(fā)酵時(shí)間也從49 h縮短為42 h,而且其發(fā)酵性能十分優(yōu)良,非常有利于生物乙醇的工業(yè)化發(fā)展。

3.2 增強(qiáng)對周圍環(huán)境的耐受性

釀酒酵母的最適生長溫度大多為30～35℃,這也是大量產(chǎn)生乙醇的最佳溫度,經(jīng)過紫外誘變、化學(xué)誘變及原生質(zhì)體融合等手段進(jìn)行改造,現(xiàn)在釀酒酵母能夠生長的最高溫度為45℃,但是目前關(guān)于其耐熱性的機(jī)理還不是很清楚,可其耐熱性卻又有很重要的應(yīng)用價(jià)值。在乙醇發(fā)酵中,釀酒酵母于40℃時(shí)產(chǎn)乙醇能力已明顯下降或發(fā)酵速度減緩,甚至徹底喪失發(fā)酵功能,必須配以制冷設(shè)備才能維持正常生產(chǎn),這增加了設(shè)備投資和運(yùn)行費(fèi)用,故每年釀酒廠不得不支付大量的冷卻設(shè)備及耗電的費(fèi)用[8]。由此可見,高溫釀酒酵母的選育具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí),在乙醇發(fā)酵工藝中,若乙醇濃度過高對酵母菌生長和發(fā)酵亦會產(chǎn)生抑制作用。

王灝等[9]以3株釀酒酵母菌f4、f5及f6作為出發(fā)菌株,進(jìn)行2輪Genome shuffling,篩選得到耐高溫和耐乙醇性能都較好的菌株R24,在35℃發(fā)酵,發(fā)酵液中的最高乙醇濃度為12.93%(體積比),比原始出發(fā)菌株f4提高了約5%,結(jié)果證明通過Genome shuffling的方法能夠選育出既耐受較高溫度又耐受較高乙醇的菌株,同時(shí)也表明該技術(shù)的確如原理所闡述的那樣,能夠?qū)⒁鹫酝蛔兊牟煌蛑亟M到同一個細(xì)胞株中,獲得優(yōu)良菌株,發(fā)揮改良菌種的作用[10]。陸筑鳳等[11]對茅臺酒廠生產(chǎn)用菌AS2109和神舟5號飛船搭載的茅臺大曲中篩得的Y14,經(jīng)過紫外誘變方法和篩選,獲得了5個耐性有所提高的正突變株,以這些菌株作為出發(fā)菌,再利用Genome shuffling的方法獲得了能耐受46℃高溫和16%(體積比)乙醇濃度的酵母菌,耐高溫和耐酒精能力比親本分別提高了7%和33%。2009年,研究者[12]對工業(yè)釀酒酵母S M-3進(jìn)行原生質(zhì)體誘變,通過篩選獲得性狀有所提高的菌株作為基因重排的出發(fā)菌株,再進(jìn)行3輪的Genome shuffling,得到菌株F34,結(jié)果表明,Genome shuffling能將多種有益的突變組合在一起,該菌株能在高達(dá)55℃的高溫進(jìn)行生長,在45～48℃時(shí),在48 h內(nèi)能夠完全利用20%(質(zhì)量體積比)的葡萄糖,產(chǎn)生9.95%(體積比)的乙醇,同時(shí)可耐受25%(體積比)的乙醇,這是首次對工業(yè)釀酒酵母進(jìn)行完美的改造,使其既能耐高溫又能高產(chǎn)乙醇同時(shí)還耐受乙醇,但需要加以改進(jìn)的就是在高溫下其發(fā)酵能力受到了一定的限制,同時(shí)其產(chǎn)生的乙醇較易蒸發(fā)[13]。

3.3 改進(jìn)釀酒酵母的其他性狀

釀酒工業(yè)一般要求所使用的酵母具有耐高溫、耐乙醇、高產(chǎn)乙醇、糖化力強(qiáng)[8]、能夠產(chǎn)香、有較好的絮凝性[14]、能夠降解蘋果酸[8,14]等優(yōu)良的生產(chǎn)性狀。生產(chǎn)不同產(chǎn)品所需的酵母性狀有所不同,但每一種產(chǎn)品的生產(chǎn)都需要具有多種優(yōu)良性狀的菌種,而真正具有多種優(yōu)良性狀的菌株又寥寥無幾。因此,應(yīng)用Genome shuffling實(shí)現(xiàn)多種優(yōu)良性狀的整合,構(gòu)建出理想的酵母菌株,將對釀酒工業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。

4 Genome shuffling的前景展望

Genome shuffling已經(jīng)成功地應(yīng)用在乳酸桿菌中提高對酸的耐受性、Streptom yces fradiae中提高泰樂菌素的產(chǎn)量以及在Sphingobium chlorophenolicum中提高對五氯苯酚的降解效率[4,6,12,15]。因此,有理由相信,在釀酒酵母的應(yīng)用上,該技術(shù)一定也可以顯示其強(qiáng)大的生命力。有學(xué)者預(yù)言“Genome shuffling的建立與日益成熟,必將引起傳統(tǒng)微生物育種及發(fā)酵生產(chǎn)的一場革命[16]。”

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