葡萄酒中低產(chǎn)尿素酵母菌的分子生物學(xué)鑒定與評(píng)價(jià)*

劉樹文，張劍，，鐘其頂，熊正河，張輝，周韓玲

1(西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌，712100) 2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)3(中糧酒業(yè)有限公司，北京，100020)

酵母發(fā)酵產(chǎn)生酒精時(shí)，涉及己糖磷酸化、糖裂解、丙酮酸分解和甘油發(fā)酵等一系列過程，生成的產(chǎn)物除酒精外，還有很多發(fā)酵副產(chǎn)物［1］。其中，葡萄酒中的大部分尿素就是經(jīng)過酵母菌細(xì)胞內(nèi)精氨酸酶-尿酶(AU)途徑將精氨酸代謝而來。

圖1 酵母菌的尿素代謝途徑

大量研究表明，在葡萄酒中尿素可以和乙醇反應(yīng)形成氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate，簡(jiǎn)稱EC)，而EC是國(guó)際癌癥研究所已經(jīng)證實(shí)的致癌物，世界衛(wèi)生組織已對(duì)軟飲料中EC制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。葡萄酒中EC主要由此反應(yīng)而產(chǎn)生，因而尿素也就被認(rèn)為是形成EC的主要前體物質(zhì)［2］。Kodama 等［3］人研究表明，葡萄酒中的尿素含量不要超過2 mg/L，否則，佐餐葡萄酒中EC的潛在濃度就可能超過美國(guó)非強(qiáng)制性限量標(biāo)準(zhǔn)15 mg/L。Kodama［4］通過添加酸性脲酶來實(shí)現(xiàn)對(duì)EC 的控制，而 Schehl和 Dahabieh［6］利用基因工程的方法來降低EC的含量。這些方法歸根結(jié)底就是減少EC的主要前體物質(zhì)尿素，而尿素主要由酵母代謝產(chǎn)生。本研究是利用分子生物學(xué)鑒定技術(shù)針對(duì)性篩選野生酵母菌株，通過與活性干酵母相對(duì)照，評(píng)價(jià)其產(chǎn)尿素能力，以期選育低產(chǎn)尿素的酵母菌株，提高我國(guó)葡萄酒產(chǎn)區(qū)酵母安全性和多樣性。

酵母菌的傳統(tǒng)鑒定方法主要依據(jù)形態(tài)和生理生化特征，但這些方法測(cè)試項(xiàng)目多，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且易受培養(yǎng)條件的影響而出現(xiàn)不確定的結(jié)果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析，5.8S-ITS區(qū) PCR-RFLP，RAPD，AFLP和種特異性DNA探針等［7－12］方法已用于酵母菌的鑒定，以前兩種方法應(yīng)用得最為廣泛。Kurtzman 和 Fell［7－8］測(cè)定了有型性與無型性子囊菌酵母和擔(dān)子菌酵母幾乎所有模式菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)的堿基序列，發(fā)現(xiàn)這段序列可以將絕大部分的種區(qū)分開來，種內(nèi)不同菌株堿基差異不大于1%。這些序列均已公布在Gen-Bank/EMBL/DDBJ等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫中，為以后酵母菌的分類和鑒定帶來了極大的便利。Esteve-Zarzoso等［9］人又根據(jù)5.8S-ITS區(qū)具有顯著的種間差異性特點(diǎn)建立了基于這一序列的PCR-RFLP方法，以此來快速鑒定酵母菌。之后，5.8S-ITS區(qū)RFLP的數(shù)據(jù)庫(http://www.yeast-id.com)也因此建立并發(fā)展起來。

1 材料與方法

1.1 材料

8株從自然發(fā)酵的葡萄酒中分離、純化得到的野生酵母菌株，即 M8，M18，M24，M39，M42，M53，M59，M66。已知菌株1964，31084，31501均為S.cerevisiae，購于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)。菌株C1，C2，C3，C4，C5為5株工業(yè)活性干酵母。

引物 NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')/NL4(5'-GGTCCGTGTTTC AAGACGG-3')，ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')/ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇)由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定

挑取活化的酵母菌于30 μL的無菌水中，98℃熱激8 min以破碎細(xì)胞釋放DNA，取上清液作為模板。PCR 反應(yīng)體系:5 μL 10 × buffer;4 μL dNTP(2.5 mmol/L，TaKaRa);1 μL NL1/NL4(20 μmol/L);Taq酶(TaKaRa)1.5U;模板3 μL;用無菌水稀釋至50 μL。PCR 循環(huán)為 95℃ 5 min;95℃ 1 min;52℃ 1 min;72℃ 2 min;35次循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送交華大基因公司測(cè)序。所得序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索(blast search)，然后比較分離菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的相似度，并以Clustal X和MEGA4.0軟件和Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 5.8S-ITS區(qū)PCR-RFLP

使用引物ITS1和ITS4對(duì)酵母菌5.8S-ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件參考文獻(xiàn)［9］，PCR產(chǎn)物經(jīng) HhaⅠ，HaeⅢ，HinfⅠ(TaKaRa)3 種限制性內(nèi)切酶消化后，在2%瓊脂糖凝膠中電泳分析。

1.4 模擬發(fā)酵

酵母菌用滅菌的葡萄汁進(jìn)行活化，然后接種于150 mL 90℃處理20 min的葡萄汁(23°Brix，pH值3.3)中，在三角瓶中(20±1)℃發(fā)酵，發(fā)酵完成后將樣品保存于－20℃，待分析。

1.5 尿素的測(cè)定

尿素的測(cè)定參考文獻(xiàn)［13］稍加改動(dòng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)的鑒定

利用引物NL1和NL4對(duì)8株野生酵母26S rDNA的D1/D2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得8個(gè)序列，其產(chǎn)物在586—601bp之間。每個(gè)序列經(jīng)BLAST分析及序列相似性計(jì)算，其26S rRNA D1/D2區(qū)基因序列與相關(guān)模式菌株信息見表1。

表1 待鑒定菌株26S rRNA D1/D2序列與相關(guān)模式菌株的序列相似性

以8株待鑒定的菌株和與5株相關(guān)模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而分析菌株間的親緣關(guān)系(見圖2)。酵母屬(Saccharomyces)，接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，有孢漢生酵母屬(Hanseniaspora)，假絲酵母屬(Candida)處于同一個(gè)主枝;而梅奇酵母屬(Metschnikowia)處于另一個(gè)主枝，與它們親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

M18、M24、M39、M42 與S.cerevisiae以較高置信度聚為一類，且與S.cerevisiaeNRRL Y-12632同源性均高于99.3%，屬于同一物種。M59與Z.bailiiNRRL Y-2227T同源性為99.6%，聚在同一分支上。M8與H.uvarumNRRL Y-1614T以較高置信度聚為一類，同源性為99.8%，屬于同一物種。而M66與C.parapsilosisNRRL Y-12969T同源性為100%，聚在同一分支，屬于同一物種。而M53與這7株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與M.pulcherrimaNRRL Y-7111T的同源性為99.4%，以較高置信度聚為一類，可以確定為同一個(gè)種。

圖2 基于酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列和Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 酵母菌5.8S-ITS區(qū)PCR-RFLP鑒定

利用ITS1和ITS4對(duì)8株野生酵母和3株已知菌株進(jìn)行5.8S-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為400－860bp，并分別經(jīng)過3種限制性內(nèi)切酶HhaⅠ，HaeⅢ，HinfⅠ進(jìn)行酶切。

菌株 M18、M24、M39、M42 的 HhaⅠ酶切片段大小為380+360+120，HaeⅢ和HinfⅠ酶切片段大小分別為320+230+180+140，370+370+120，與已知菌株1964，31084，31501酶切類型一致，因此將4株鑒定為S.cerevisiae。菌株M8的擴(kuò)增片段約750bp，不能被HaeⅢ消化，HhaⅠ和HinfⅠ酶切結(jié)果分別為320+320，350+200+180，與數(shù)據(jù)庫中基本一致，被鑒定為H.uvarum。菌株M53和M66擴(kuò)增片段較小，分別為400bp和550bp，M59擴(kuò)增片段為780bp，其酶切結(jié)果見表2，與數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌種的酶切信息基本一致，分別鑒定為 M.pulcherrima、C.parapsilosis和Z.bailii。

表2 酵母菌株5.8S-ITS PCR產(chǎn)物和限制性酶切片段長(zhǎng)度

供試的野生酵母采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析和5.8S-ITS區(qū)PCR-RFLP兩種方法鑒定，其鑒定結(jié)果相同。

2.3 不同酵母菌代謝尿素能力的評(píng)價(jià)

對(duì)5株活性干酵母和11株野生酵母進(jìn)行了模擬發(fā)酵并測(cè)定其尿素含量(見表3)。

表3 不同酵母菌株代謝尿素的含量

不同酵母代謝尿素的能力存在差異。其中5株活性干酵母代謝尿素含量普遍較低，菌株C1和C2代謝的尿素含量較低，分別為0.738 mg/L和0.656 mg/L，這可能是活性干酵母的代謝活動(dòng)比野生酵母較為旺盛，發(fā)酵能力也較強(qiáng)，消耗葡萄汁中的氮源，尿素也作為氮源而被利用。而野生酵母代謝尿素的含量普遍比活性干酵母高，菌株M39最高為3.91 mg/L，這是由于酵母菌一方面會(huì)利用氮源，降解一部分尿素，同時(shí)也會(huì)代謝精氨酸產(chǎn)生尿素，除了滿足自身需要外，多余的尿素被分泌到體外，使得酒中尿素含量增加。

酵母菌代謝尿素不僅與菌株本身有關(guān)，還受乙醇、氨基酸等培養(yǎng)條件的影響［14－15］。乙醇抑制了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和酵母的生長(zhǎng)，從而影響了酵母代謝產(chǎn)生尿素。氨和谷氨酰胺會(huì)明顯抑制酵母對(duì)尿素的吸收，而不同濃度的蘇氨酸、丙氨酸、絲氨酸對(duì)酵母菌代謝尿素的影響較?。?5］。

2.4 葡萄酒發(fā)酵過程中尿素的變化

跟蹤了菌株M18在發(fā)酵過程中尿素含量變化(見圖3)。在發(fā)酵前一個(gè)星期尿素含量有所減少，這是由于酵母在前期大量繁殖，消耗葡萄汁中的氮源，而尿素作為氮源被利用，但在10 d后葡萄汁中營(yíng)養(yǎng)大量消耗，酒精大量產(chǎn)生，酵母生長(zhǎng)受到抑制，酵母也會(huì)通過精氨酸代謝產(chǎn)生尿素，使得發(fā)酵液中尿素出現(xiàn)上升趨勢(shì)。而在帶酒泥儲(chǔ)存一段時(shí)間后，尿素含量也有明顯升高的趨勢(shì)。

2.5 不同精氨酸添加量對(duì)發(fā)酵后尿素含量的影響

在葡萄汁中分別添加500，1 000，1 500 μg/mL精氨酸后接種M18菌株，跟蹤20d和40d的尿素含量變化(見圖4)。

圖4 不同精氨酸添加量對(duì)尿素代謝的影響

在發(fā)酵20 d時(shí)，添加精氨酸產(chǎn)生的尿素明顯高于未添加精氨酸的含量，添加1 500 μg/mL精氨酸發(fā)酵后尿素的含量是未添加的4.36倍，是添加500 mg/L的2.06倍。表明添加精氨酸后尿素的含量會(huì)有所升高，且添加越多，尿素的含量也有增加的趨勢(shì)。這種趨勢(shì)同樣在進(jìn)入貯存期40 d的情況相一致，且含量都有升高，這些都與酵母菌代謝精氨酸產(chǎn)生尿素密切相關(guān)。因此葡萄汁中的精氨酸含量對(duì)發(fā)酵后葡萄酒中的EC具有潛在的影響，Ough等［16］報(bào)道，當(dāng)葡萄汁中精氨酸濃度超過800～1 000 mg/L時(shí)，可認(rèn)為葡萄園施肥過量。這就需要調(diào)整葡萄園的管理，控制其精氨酸的含量，從而降低葡萄酒中尿素含量。

3 結(jié)論

采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析和5.8S-ITS區(qū)PCR-RFLP兩種分子生物學(xué)方法對(duì)分離于葡萄酒中的8株野生酵母進(jìn)行了鑒定，其中4株為S.cerevisiae，其余 4 株分別是H.uvarum、M.pulcherrima、Z.bailii、C.parapsilosis。2種方法鑒定結(jié)果一致。

評(píng)價(jià)了8株野生酵母、3株野生酵母和5株工業(yè)活性干酵母代謝尿素能力，不同的菌株存在差異性且野生酵母代謝尿素的含量明顯高于活性干酵母。在發(fā)酵過程中，尿素含量與酵母菌的生長(zhǎng)狀況密切相關(guān)。在發(fā)酵開始階段，尿素含量有所下降，酵母菌利用了一部分尿素，但在隨后的發(fā)酵過程中，酵母菌代謝精氨酸產(chǎn)生尿素，使葡萄酒中尿素含量增加。另外，葡萄汁中精氨酸的濃度也影響其尿素的含量，因此，控制葡萄汁中精氨酸的含量是降低因酵母代謝而產(chǎn)生尿素的有效途徑之一。

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