傳統魚露發酵的微生物動態分析*

黃紫燕，朱志偉，曾慶孝，張永絲，簡永舜

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州，510640)

魚露是我國典型的傳統調味品之一，其獨特的風味是在釀造過程中，由微生物引起的一系列生化變化形成的［2］。目前，我國魚露的加工生產需要2～3年的時間，生產周期較長，生產成本高，縮短發酵時間是急需解決的問題。以往的研究主要側重于從物理、化學方面優化加工工藝，生產周期大大縮短，但無法還原魚露天然風味。

魚露發酵過程中要對微生物進行選擇性培養，生存下來的優勢菌可通過發酵賦予產品主要滋味。對魚露風味有直接關系的微生物是酵母菌和乳酸菌。在黃豆醬、醬油等發酵食品的實際生產中，一些工廠會在發酵后期加入乳酸菌與酵母菌發酵液，以增加其風味物質的形成［3］。魚露發酵過程中其品質特征形成規律仍不為人們所了解，目前仍未見對魚露傳統發酵過程中微生物的動態分析及優勢菌群的分析［4］。

本實驗以傳統發酵工藝制作魚露，研究發酵過程中不同階段的微生物的消長變化，檢測pH值、總酸、總酯、乙醇含量、TSN、AAN、TVB-N等理化指標，分析游離氨基酸組成與含量，將這3者結果結合起來綜合分析，試圖找出加工過程中微生物與游離氨基酸形成、風味形成的關系，明確微生物的作用，初步探討發酵機理。我們可以以此為理論依據，選擇合適時期有目的的添加合適的發酵菌種，保證風味的基礎上加快發酵進程，應用在魚露的實際生產中，科學指導魚露快速發酵［5］。

1 材料與方法

1.1 原材料及樣品準備

發酵魚露由廣東省汕頭魚露廠有限公司提供。以鳀魚(Engraulis japonicus)為原料，加30%的海鹽混勻，在(30±5)℃下自然發酵3年，在不同階段取出發酵液進行分析。取樣時，將魚露發酵液混勻，取適量混合液，部分用于微生物檢測，部分用濾紙(新星，102#定性濾紙Ф12.5cm)過濾，濾液沸水浴10 min后用于理化指標分析。

1.2 微生物檢測

計數總菌，用顯微鏡(CX31RTSF，OLYMPUS，日本)觀察;計數菌落總數，采用營養瓊脂培養基;計數細菌數，采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基;計數乳酸菌數，采用MRS培養基;計數產蛋白酶乳酸菌數，采用TSA培養基;計數酵母菌數，采用麥芽汁瓊脂培養基;計數霉菌數，采用察氏瓊脂培養基［4，6］。

選取菌落數在30～300之間的平板作為菌落數測定標準，1個稀釋度選用2個平板。

1.3 理化指標的測定

總可溶性氮(TSN)，凱氏定氮法［7］;氨基酸態氮(AAN)，甲醛滴定法［6］;揮發性鹽基氮(TVB-N)，康維皿法(微量擴散法)［8］;pH 值，按照 GB/T10786－1989方法，用數字式pH計(pHS－3C，上海精密科學儀器有限公司)測定;總酸，GB/T 12456－1990;總酯，按照GB/T 10345.5－1989測定;揮發性風味物質中乙醇含量的測定，采用氣相色譜-質譜聯用(GCMS)進行定性定量分析［9］。

所有的試驗至少進行3次，計算相應的標準偏差。指標內部的均值比較采用最小顯著差異法(Least significant difference，LSD)，取 95% 置信度(P＜0.05)。

1.4 游離氨基酸組成的測定

游離氨基酸的測定采用高效液相色譜法，采用Waters高效液相色譜儀和PICO.TAG氨基酸分析柱，檢測波長為254 nm，柱溫為38℃，流速為1 mL/min。標準氨基酸溶液為Sigma產品。數達到最大，其對數值為8.0，而后開始緩慢下降，大部分微生物，尤其是不適鹽微生物逐漸被淘汰，直到進入后期保溫發酵期(55～60℃)時，無需經殺菌即可得商業魚露。

2 結果與討論

2.1 魚露發酵過程微生物菌系的消長變化分析

對汕頭魚露廠釀造的魚露進行鏡檢及平板稀釋分離計數，結果見圖1。從圖1中可以發現，在魚露傳統發酵的整個過程中，各類微生物數量相差很大，顯微鏡計數結果比倒平板實驗結果平均高出2個對數值。發酵前半年，優勢菌互相交替，為魚露發酵主要活動期，而后慢慢穩定。在發酵3～4個月時菌落總

圖1 傳統魚露發酵過程主要微生物的消長變化

結合圖1、圖2可以看出，魚露中含有豐富的耐鹽性乳酸菌，尤其是產蛋白酶乳酸菌。在整個發酵期間，乳酸菌的數量一直高于其他2種菌，是整個發酵期的優勢菌，所占比例維持在30%以上。在發酵2～4個月時其數量達到最大值，對數值為7.5～7.6。發酵1年以后，菌相組成相對穩定，乳酸菌占菌落總數的比例維持在60%左右。乳酸菌發酵使環境pH值下降。

在發酵初期，由于海鹽尚未滲入魚體，魚汁尚未滲出，魚鹽空隙存在空氣，大量的霉菌開始生長。發酵至15天時，霉菌最先達到最大量，對數值為6.19，占菌落總數的66%，是發酵初期的優勢菌。霉菌分泌出各種蛋白酶，使蛋白質水解成為多肽、氨基酸等，為后階段其他微生物的生長創造條件。但隨著海鹽滲入魚體，魚汁滲出，魚鹽間空隙被填滿，高食鹽濃度和缺乏氧氣使霉菌生長變緩，霉菌數量減少。

霉菌分泌的酶類發揮作用，乳酸發酵使pH值下降到一定程度，且存在厭氧環境，酵母菌大量繁殖。從發酵開始，酵母菌數量不斷增多，從最開始對數值為3.5，發酵3個月時，對數值已達到7.8，占菌落總數的63%，成為該時期的優勢菌。在發酵2～4個月時，乳酸菌和酵母菌這兩種優勢菌體之間引起競爭進行酒精發酵，生成乙醇，進而促進各種香氣成分的生成［10］。酵母和乳酸菌的混合發酵能產香、產酒精，與單純的乳酸發酵相比，酸味適口［11］。而后由于環境pH值的不斷下降，酵母菌數量逐漸減少，發酵1年以后，其所占的比例基本穩定，為30%。

2.2 魚露發酵過程pH值、總酸含量的變化

酸度是反映乳酸發酵進程的一個重要指標，魚露發酵過程中pH值、總酸含量的變化如圖3所示。

結合微生物變化分析，耐鹽乳酸菌是整個發酵期間的優勢菌，魚露中的主體酸是乳酸，它使發酵液中pH值下降。由圖3可看出，在發酵前0.5個月，由于乳酸菌與其他雜菌相競爭，尚未成為優勢菌，發酵過程中腐敗菌生長較旺盛，有些蛋白質被分解為揮發性鹽基氮，使pH值大幅度上升，發酵15 d，發酵液中pH值高達5.90。發酵2～3個月時，乳酸菌抑制住雜菌，開始成為環境中的優勢菌，環境pH值呈緩慢下降狀態。

5.仔豬副傷寒。由沙門氏菌引起，多發生于2～4月齡的仔豬，無明顯的季節性。急性型：呈敗血癥癥狀，突然發病，體溫升高，食欲廢絕，初便秘，后下痢，排惡臭稀糞，病后2～3 d在鼻端、兩耳及四肢下部皮膚發紫，病豬低頭呆立，步態搖晃，體溫下降，不久死亡。慢性型最多見，病豬呈漸進性消瘦，體溫略升高，精神不振，初便秘，后呈持續性或間歇性腹瀉，排淡黃色或黃綠色惡臭稀便，混有血液、壞死組織。剖檢急性呈敗血癥變化；慢性腸黏膜呈彌漫性壞死性糜爛。

圖3 傳統魚露發酵過程中PH及總酸含量的變化

發酵液中總酸的變化與pH值變化基本相反。已有研究認為，酸類來源于脂肪酸的氧化或者微生物對氨基酸發酵作用［12－13］;尤其來自那些能耐高濃度鹽的菌種，Beddows等研究證明，產揮發性脂肪酸的細菌在魚和富含蛋白質的培養基上生長良好［14］。故發酵3個月后酸度不斷上升，表明魚露發酵過程中產生揮發性脂肪酸，使得魚露中酸類物質(如乳酸、琥珀酸、檸檬酸等)含量不斷升高，大量低分子量的揮發性有機酸，如乙酸、丁酸、丙酸開始形成，它們是魚露中的主要風味物質，賦予魚露干酪的風味［15］。

2.3 魚露發酵過程TSN、AAN、TVB-N含量的變化

TSN、AAN、TVB-N是能反映微生物群體利用氮源發酵的情況的指標，是反映魚體蛋白質被分解情況的指標，也是魚露質量分級的重要指標，其發酵過程的變化如圖4所示。

圖4 傳統魚露發酵過程中TSN、AAN、TVB-N含量的變化

TSN和AAN含量的變化趨勢相一致，隨發酵時間的延長而逐漸增加。在發酵前6個月快速增長，隨后增長變緩。發酵6個月時，TSN含量已達1.43 g/100 mL，蛋白質轉化率為51.8%。這可能是由于發酵初期，各種優勢菌相互交替出現，乳酸菌、酵母菌處于活躍期，尤其是乳酸菌能分泌出蛋白酶，原料魚蛋白質在半年內基本完成水解。

TVB-N是衡量魚露腐敗變質的1個重要指標，其形成主要是由于魚體在發酵過程中腐敗微生物的生長，將蛋白質分解成氨基酸后，再進一步分解為氨、三甲胺等揮發性鹽基含氮化合物［16］。圖3結果顯示，發酵前一個月，發酵液的TVB-N含量增長較快，可以推斷優勢菌尚未抑制住雜菌，隨后在2～4個月時，TVB-N含量基本不增長，可能是由于乳酸菌、酵母菌的迅速繁殖，這與圖1結果相吻合。

2.4 魚露發酵過程總酯、乙醇含量的變化

發酵液中乙醇含量是能反映酵母菌發酵進程的一個指標，發酵過程總酯、乙醇含量變化如圖5所示。

圖5 傳統魚露發酵過程中總酯及乙醇含量的變化

在魚露的揮發性風味物質中，乙醇是最先快速生長的物質。由圖5可以看出，在發酵前1年，2大優勢菌體競爭引起乙醇的快速生長。從發酵初期開始，由于酵母菌的大量繁殖，乙醇隨發酵時間延長不斷增長，到發酵1年時達到最大值，含量占揮發性風味物質總量的28.83%。而發酵一年以后，乙醇可能通過被氧化成醛、酮類，進而氧化成酸，慢慢轉化為其他風味物質，相對含量逐漸減少，到發酵3年后，乙醇含量僅占11.66%。乙醇是魚露中主要風味物質生成的前體物。

潮汕魚露的獨特風味在3年的發酵過程中逐漸形成，其間總酯含量不斷上升，尤其是第2～3年時上升很快，從2.08 g/100 mL上升到3.40 g/100 mL，增長了49.7%，與乙醇含量的迅速下降形成鮮明對比。酯類中的2-硝基丙酸乙酯、二甲酯、乙酸乙酯等［13］相互協同，共同構成魚露的特殊風味。

2.5 魚露發酵過程中游離氨基酸組成與含量的變化

表1 魚露發酵過程中游離氨基酸的組成與含量mg/100g

游離氨基酸組成與含量測定結果見表1，可以看出，潮汕魚露中游離氨基酸總量隨著發酵時間的延長不斷增加(P＜0.05)，發酵各階段樣液中谷氨酸含量都較高并不斷增加，這表明魚露的鮮味形成需要一定的時間。發酵3年后，終產品的游離氨基酸總量為5 705.79 mg/100 mL，而在發酵半年后其游離氨基酸總量已達到4 866.66 mg/100 mL，說明游離氨基酸的主要形成時間是在發酵的前6個月，其后游離氨基酸總量緩慢上升。這可能是由于發酵初期，各種優勢菌相互交替出現，乳酸菌、酵母菌處于活躍期，尤其是乳酸菌能分泌出蛋白酶，原料魚蛋白質在半年內基本完成水解。但隨后環境pH值下降、溫度升高，乳酸菌、酵母菌數量減少，魚露發酵速度下降。這時可以在魚露中適量添加這2種優勢菌，加速發酵，以利于風味和滋味物質的形成，從而縮短魚露產品的陳化和后熟時間。

色氨酸、絲氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的含量在發酵一年期間時而升高時而降低，明顯波動，這與發酵初期優勢菌體不能穩定有關，也說明氨基酸是魚露揮發性化合物的重要前體物，例如特征揮發性化合物中的含硫化合物由含硫氨基酸轉化而來。

3 結論

(1)魚露發酵15d時發酵液中霉菌數達到最大值，是發酵初期的優勢菌;3個月時酵母菌取代之;乳酸菌是整個發酵期間的優勢菌，其含量在2～4個月達到最大，其對數值為7.5。

(2)乳酸菌生長使環境中pH值下降，促進酵母菌生長，兩菌競爭使乙醇得到迅速增長，在發酵1年時達到最大，占揮發性風味物質總量的28.83%，隨后，乙醇慢慢轉化為魚露中其他揮發性風味物質，而此時總酯含量逐漸增大，最后一年增加了49.7%。

(3)發酵初期微生物生長比較活躍，數量較多，分泌出蛋白酶促使蛋白質降解，TSN、AAN、TVB-N含量在前6個月增長較快，游離氨基酸形成主要在發酵前半年，隨著微生物數量下降，其增長速度也減緩，可以適量添加優勢菌株，加速發酵，以利于風味和滋味物質的形成，從而縮短魚露產品的陳化和后熟時間。

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