天津地區漢族人群E-選擇素A561C基因多態性與2型糖尿病相關性研究

劉莎莎 林靜娜 馮 憑

天津地區漢族人群E-選擇素A561C基因多態性與2型糖尿病相關性研究

劉莎莎 林靜娜 馮 憑

目的：探討E-選擇素基因A561C多態性與天津地區漢族人群2型糖尿病（T2DM）的關系。方法：利用試劑盒說明書方法提取DNA后，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）方法檢測112例T2DM和健康體檢者140例（對照組）A561C多態性，并采用微粒子化學發光全自動免疫分析法和全自動生化儀檢測臨床生化指標。結果：在112例T2DM患者中，檢出12例雜合子突變基因型（AC），C等位基因頻率為5.36%；在140例對照組中，檢出4例AC，C等位基因頻率為1.43%，2組均未檢出突變純合子（CC），差異有統計學意義（P＜0.05）；以基因型分組，112例T2DM患者中AC組空腹血糖（FPG）和餐后2 h血糖（P2PG）值均高于AA組，空腹血胰島素（FINS）低于AA組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：C等位基因可能為天津地區漢族人群T2DM易感基因，E-選擇素基因多態性在T2DM的發生與發展中有一定作用。

糖尿病，2型 E選擇素 多態現象,遺傳 基因型 基因頻率 天津 漢族

目前，全球約有2億糖尿病患者，預計到2025年將增至3.3億[1]。糖尿病是心腦血管疾病發生的獨立危險因素。因此，糖尿病及其并發癥的防治已經成為全球嚴重的公共衛生問題。研究發現，E-選擇素高表達與高血糖[2]、遺傳[3]等因素相關。本研究對E-選擇素基因表皮生長樣區561位點進行多態性檢測，探討其與天津地區漢族人群2型糖尿病（T2DM）的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取天津醫科大學總醫院2005年7月—12月門診無血緣關系T2DM患者112例（T2DM組），男53例，女 59 例，平均年齡（47．3±7．6）歲。選取同時期健康體檢者為正常對照組，相互之間無血緣關系，共140例，男82例，女58 例，平均年齡（46．7±7．5）歲，2 組人群均為中國北方天津地區漢族人，T2DM的診斷依據WHO1999年標準。2組間性別（χ2=1.781）、年齡（t=1.576）比較差異無統計學意義（均 P>0.05）。2組均測量收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和體質量指數（BMI）。禁食12 h后，取次日空腹肱靜脈血5 mL備用。

1.2方法

1.2.1引物設計 參照文獻[4]，由大連寶生物公司合成序列如下。上游引物:5′-AGTAATAGTCCTCCTCATCATG-3′；下游引物:5′-ACCATCTCAAGTGAAGAAAGAG-3′。

1.2.2全血DNA的提取 試劑盒法提取全血DNA，試劑盒購自大連寶生物公司。

1.2.3聚合酶鏈反應（PCR） PCR體系總體積50 μL，其中10 倍 PCR 緩沖液 5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.6 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上、下游引物各 2 μL（20 pmol），模板 DNA 5 μL，體積不足由滅菌純凈水補充，放于熱循環擴增儀（德國Eppendorf公司，PE-9700型）：94℃預變性5 min，后進行94℃變性30 s，61℃退火 60 s，72℃延伸60 s，循環35次。末次循環后，72℃延伸5 min，之后放于4℃保存。

1.2.4擴增產物的限制性片段長度多態性分析 PCR產物10 μL，限制性內切酶 PstUⅠ（大連寶生物公司）1.8 μL，緩沖液2 μL，體積不足由滅菌純凈水補充，反應體系放于37℃水浴5 h，取8 μL產物與0.8 μL上樣緩沖液混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統上照相保存。

1.2.5生化檢測 采用微粒子化學發光全自動免疫分析法檢測空腹血胰島素（FINS）。采用日立公司7170A全自動生化儀檢測空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（P2PG）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.3統計學方法 用SPSS 13.0軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以±s表示，行t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。基因分布平衡性檢驗采用χ2檢驗判定基因分布是否符合Hardy-Weinberg定律，單個基因型及組間等位基因的頻率比較采用四格表χ2檢驗。雙側檢驗以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1基因型分析 本試驗目的基因為186 bp，酶切后AA基因型為123 bp和63 bp的兩條帶；突變型純合子（CC型），電泳后為一條帶；而突變型雜合子（AC型）產生186 bp、123 bp和63 bp共3個條帶，見圖1。2.2遺傳平衡檢驗及基因型和等位基因頻率的分布 T2DM組和對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg定律（均P>0.05），見表1。2組間基因型和A561C等位基因頻率分布差異均有統計學意義（P<0.05），見表 2。

圖1 酶切產物瓊脂糖凝膠電泳結果

表1 E-selectin基因A561C突變遺傳平衡性檢驗（例）

表2 2組基因型和等位基因頻率分布的比較

2.3DM患者中不同基因型各項指標比較 AC組FPG和P2PG均高于AA組，FINS低于AA組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。AC組TC、TG和BMI較AA組高，但差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

表3 不同基因型的臨床資料（±s）

表3 不同基因型的臨床資料（±s）

*P ＜ 0．05，**P ＜ 0．01

AA AC t 100 12 SBP（mm Hg）114±16 113±9 0.278 DBP（mm Hg）76±8 76±8 0.045 BMI（kg/m2）24.41±2.47 24.45±2.08 0.058 TC（mmol/L）4.7±0.7 5.0±0.6 1.62 TG（mmol/L）1.43±1.00 1.63±1.07 0.774組別 n HDL-C（mmol/L）1.50±0.37 1.45±0.34 0.559 AA AC t 100 12 LDL-C（mmol/L）2.56±0.59 2.48±0.78 0.523 FPG（mmol/L）6.31±2.05 7.83±2.18 2.841**P2PG（mmol/L）8.87±2.78 10.65±2.65 2.484*FINS（mIU/L）8.38±2.36 7.90±1.86 1.991*組別 n

3 討論

T2DM占所有糖尿病的95%以上，遺傳因素在T2DM人群中起著重要的作用。因此，尋找與其相關及致病的基因已成為國內外近年來研究的熱點。目前只有少數單基因形式T2DM的致病基因被找到。

E-選擇素發現于1985年，基因全長約13 kb，位于第1號染色體長臂，由14個外顯子及13內含子組成，其中第4外顯子編碼E-選擇素表皮生長樣結構域，這一結構域的缺失將減弱E-選擇素介導的黏附作用。Wenzel等[5]首先證實了E-選擇素第4外顯子的561位存在A→C的突變，并導致所編碼的第128位氨基酸由絲氨酸變成精氨酸（Ser128Arg）。此多態性可能影響E-選擇素的基因表達和功能，與一些疾病的發生、發展有一定的關聯[6]。英國學者首先報道E-選擇素A561C多態性與英國白種人T2DM相關[7]，國內武漢報道E-選擇素A561C多態性與湖北地區漢族人群T2DM相關，但E-選擇素基因型間血糖血脂水平差異無統計學意義[8]。本研究運用PCR-RFLP分析檢測C等位基因為天津地區漢族人群T2DM易感基因，E-選擇素基因型間FPG、P2PG和FINS有一定的差異，這與以前國內報道有所不同。同時，國外學者Ellsworth等[9]研究表明，E-選擇素基因多態性頻率分布有明顯的種族、地區差異，E-選擇素中C等位基因頻率在美國、德國、英國人群中分布分別為15.4%、8.7%和11.4%。我國C等位基因頻率明顯低于西方國家人群，文獻報道僅為2.6%[8]，本研究顯示T2DM組和對照組整體C等位基因頻率3.1%，說明不同種族基因突變頻率存在顯著差異，這些種族差異可能是中國與西方國家糖尿病致病和易感基因有所不同。

綜上所述，從分子水平了解E-選擇素基因多態性在我國人群中的分布，可以探討不同基因在T2DM的發病及其發展中的交互作用，進一步從遺傳學的角度，在分子水平闡明的發病機制，擴展人們對T2DM的認識，為T2DM的預防、判斷預后提供理論依據和新的思路，為基因治療提供新的靶點，還可以對異常家系進行早期干預，以預防或延緩T2DM的發生和發展。

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Relativity Study between the E-Selectin Gene A561C Polymorphism and Diabetes Mellitus in Chinese Han Population of Tianjin

LIU Shasha，LIN Jingna，FENG Ping

Tianjin People’s Hospital，Tianjin 300121，China

Objective:To investigate the relationship between E-selectin gene A561C polymorphism and type 2 diabetes mellitus （T2DM）.Methods：Using PCR-RFLP way,the A561C polymorphism was screened in 112 patients with T2DM and 140 controls.The clinical data were analyzed.Results：Twelve patients with the heterozygote mutation(AC)were found in 112 T2DM patients,and C allele frequency was 5.36%.Four were found in 140 controls,and C allele frequency was 1.43%.There was a significant difference between the two groups(P＜0.05).No homozygote mutation(CC)was found in the two groups.The levels of fasting plasma glucose(FPG)and 2 h postprandial blood glucose(P2PG)were higher in T2DM patients of AC group than those of AA group.The level of fasting insulin(FINS)was significantly lower in T2DM patients of AC group than that of AA group(P＜0.05).Conclusion:C allele may be the T2DM-susceptibility gene in Chinese Han population of Tianjin.E-selectin gene polymorphism plays an important role in occurrence and development of diabetes mellitus.

diabetes mellitus,type 2 E-selectin polymorphism,genetic genotype gene frequency TIANJIN HAN NATIONALITY

300121 天津市人民醫院（劉莎莎，林靜娜）；天津醫科大學總醫院（馮憑）

（2010-01-25收稿 2010-06-05修回）

（本文編輯 魏杰）