天津地區嬰幼兒諾如病毒感染的分子流行病學特征

王瑞雪 彭 林 林書祥 王 維

天津地區嬰幼兒諾如病毒感染的分子流行病學特征

王瑞雪 彭 林△林書祥 王 維

目的：了解天津市地區嬰幼兒諾如病毒（NV）感染情況并對諾如病毒進行基因分型分析。方法：收集2008年8月—2009年7月天津市兒童醫院門診和住院病毒性腹瀉患兒的糞便標本。用逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）法進行檢測。測序后使用Bioedit和DNAstar基因分析軟件與GenBank中的參考株進行同源性分析并繪制系統進化樹。結果：在540例腹瀉標本中諾如病毒陽性的標本為174例，諾如病毒的陽性率為32．22%，2008年11月NV陽性率較高，為62．22%。抽取7份陽性標本進行序列分析，結果7份標本均為GⅡ－4型。結論：諾如病毒是天津地區嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原體之一，GⅡ－4型是主要流行株。

腹瀉,嬰兒 基因型 逆轉錄聚合酶鏈反應 嵌杯病毒科 序列分析 天津

諾如病毒 （Norovirus，NV） 屬于杯狀病毒（Human calicivirus，HuCV），是世界范圍內引起病毒性腹瀉的主要病原之一[1]。自1995年方肇寅等[2]首次在我國河南省急性腹瀉門診患兒便樣中發現了NV以來，我國各地相繼出現關于NV暴發和流行的報道。NV感染全年均可發生，冬季高發，人群普遍易感，可在人群中暴發，主要臨床表現為惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉，病程一般呈自限性，傳播途徑以糞-口感染為主。本研究將天津市兒童醫院收集的病毒性腹瀉患兒糞便樣本540例進行NV核酸型檢測，以了解天津地區嬰幼兒中NV的感染情況和基因型別。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2008年8月—2009年7月在兒童醫院就診的腹瀉患兒540例，男340例，女200例。年齡0.5個月～14歲，平均14個月。患兒大便呈水樣、蛋花樣或稀糊樣，次數較平時增多，伴或不伴發熱、嘔吐，有或無脫水。排除細菌、寄生蟲等感染性腹瀉和輪狀病毒檢測結果為陰性的腹瀉患兒糞便標本。糞便檢測前-20℃保存。

1.2方法

1.2.1病毒RNA的提取 取糞便約350 μL，加生理鹽水補至1.5 mL,以5 000 r/min離心10 min，取糞便稀釋標本的上清液300 μL加入500 μL Trizol（Invitrogen公司）,室溫放置5 min，再加入100 μL氯仿渦旋震蕩，4℃以12 000 r/min離心15 min。吸取上清液450 μL,將上清液移至新管，加冰異丙醇450 μL，顛倒混勻，室溫靜置 10 min。4℃以 12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入500 μL 75%冰乙醇懸浮沉淀，4℃以12 000 r/min離心15 min。棄去上清液，離心1 min，吸取上清液，棄去，室溫放10 min干燥。加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水30 μL，于 55℃～60℃溫育10 min，溶解RNA。

1.2.2引物設計 采用以諾如病毒RNA多聚酶高保守區為靶序列的引物P289/P290[3]。引物序列、位置及產物長度見表1。

表1 所用諾如病毒的引物序列

1.2.3逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR） 采用杭州博日公司BioRT Two Step RT-PCR Kit試劑盒。逆轉錄體系：5×RT Buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Oligo－dT 0．5 μL，RNase抑制劑（40 U/μL）0．5 μL，AMV 逆轉錄酶 0．5 μL，實驗樣品5.5 μL。42℃ 45 min，95℃ 5 min，冰浴 5 min。PCR 反應體系：10×RT Buffer（含 Mg2＋）2．5 μL，dNTP（10 mmol/L）0．5 μL，上游引物（5 μmol/L）0.5 μL，下游引物（5 μmol/L）1 μL，Taq 混合DNA 聚合酶 0．5 μL，RT 產物 2．5 μL，dd H2O 18 μL，總體積為25 μL，輕微離心后，放入PCR儀中擴增。反應條件：94℃3 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環，最后 72℃延伸5 min。PCR產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，相對分子質量標準購自加拿大新產業公司。

1.2.4測序及分析 隨機抽取7份NV陽性標本的PCR產物送天根生化科技有限公司進行序列測定。利用Bioedit和DNAstar對所獲得的序列進行核苷酸同源性和基因親緣性分析，參比序列均來自GenBank。

2 結果

2.1NV感染情況 540份標本中有174例在319 bp處出現NV特異性擴增條帶，陽性率為32.22%。2008年11月NV陽性率較高，為62.22%，各月份NV陽性率見圖1。

圖1 2008年8月—2009年7月嬰幼兒腹瀉糞便標本NV陽性率

2.2NV同源性分析 見圖2、3。將7份NV陽性標本的核苷酸序列與NV各基因型進行對比。其基因型編號分別為：m87661（Norwalk，GⅠ－1型），l07418（Southampton，GⅠ－2 型），u044669（Desert Shield，GⅠ－3 型），ab042808（Chiba，GⅠ－4 型），x81879（Melksham，GⅡ－1 型），u22498（Mexico，GⅡ－3型），ay502023（Farmington Hill，GⅡ－4型）。結果顯示，所測的 7個序列與 ay502023（Farmington Hill，GⅡ－4型）的參考株堿基序列同源性較其他基因型高，同源性在86．7%～96．1%之間。將所測的7個序列進行遺傳進化樹分析，樣本1與Beijing/49/2007（eu703697，GⅡ型）、Ehime5（ab447455，GⅡ－4 型）、Toyama5（ab447445，GⅡ－4型）較為接近，同源性分別為94.5%、93.5%、95.6%。樣本2與Beijing/282/2005株（eu703670，GⅡ型）最為接近，同源性達98．8% 。 樣 本 3、5、6 與 Beijing/133/2007 株（eu703706，GⅡ型）同源性在95%以上。樣本4與Beijing/133/2007株（eu703706 GⅡ型）的同源性在90%以上。樣本7與Beijing/49/2007（eu703697,GⅡ型）、Beijing/96/2007（eu703701，GⅡ型）的同源性在96%以上。所測的7個序列屬于NV的GⅡ-4型，7個序列與參考序列ay502023的部分核苷酸差異。

圖2 天津地區NV株RdRp遺傳序列進化樹

圖3 所測序列與ay502023部分序列變異比較

3 討論

NV是急性胃腸炎的主要病原，其為單股正鏈小RNA病毒，無包膜，具有20面體結構，直徑26～30 nm。NV全長7 400～7 700 bp，分為3個開放閱讀框架（opening reading frame,ORF），其中，ORF1編碼一個具有保守序列的多聚酶非結構蛋白，ORF2編碼一種分子質量約為56 kb的衣殼蛋白，ORF3編碼一種約為22.5 kb的微小結構蛋白，該蛋白的作用與功能尚不清楚。NV基因組中ORF1的RNA多聚酶區相對保守，其他區域變異相對較多，所以此區常被用來進行基因分型。NV可分為5個基因型，其中GⅠ、GⅡ、GⅣ組易感染人。Kageyama等[4]通過分析衣殼蛋白VP1基因的S區把GⅠ和GⅡ進一步分別分為14個和17個基因型，GⅡ-4型在世界范圍內廣泛流行。

發展中國家每年因NV感染而住院的患者多達110萬例，小于5歲的死亡嬰幼兒達20萬例。在發達國家每年因NV感染而住院的患者6.4萬例，門診患者 90 萬例[5]。我國的濟南[6]、上海[7]和北京[8]等地也有關于NV感染和流行的報道，NV檢出率在16.85%～38.27%之間。

GⅡ-4型是全球NV的主要流行型[9]，且GⅡ-4型不斷出現新的變異基因型,也是其近年來出現較大范圍流行的原因之一。此次檢測并測序的7份標本均為GⅡ-4型，這與國際流行趨勢符合。7份標本的核苷酸序列與北京 2005、2007年公布于GenBank數據庫的NV GⅡ-4型遺傳組序列最為接近。這可能和天津與北京地理位置相鄰，兩地人員流動性較大有關。所測的7株NV核苷酸序列與日本 2006年的 Ehine5株 （ab447455），2006年的Toyama5（ab447445）同源性在 80.1%～96.9%，而根據Guo等[10]的報道Ehime5是2004—2005年日本NV的主要流行株之一。這是否提示有日本流行株流入北京、天津，還需進一步研究和觀察。

本次監測中，NV陽性率在2008年11月—2009年2月較高，其中2008年11月NV陽性率最高。這可能與NV的增長與寒冷、人群免疫力低及新GⅡ-4抗原毒株出現有關[11]。此外，在2009年6月意大利發生的NV性胃腸炎中還同時檢測出8例混合感染有輪狀病毒[12]。在本次檢測中亦發現1例輪狀病毒陽性標本檢測出現NV陽性結果，但此標本尚未測序。是否存在混合感染仍需進一步關注。

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Characterization of Molecular Epidemiology of Norovirus Infection in Infants and Young Children in Tianjin

WANG Ruixue，PENG Lin，LIN Shuxiang，WANG Wei

Tianjin Children’s Hospital,Tianjin 300074,China

Objective:To understand the charaterization of Norovirus(NV)infection in infants and young children in Tianjin area,and study the genotype and the genetic identity of NV.Methods:The fecal specimens were collected from infants and young children with viral gastroenteritis from Tianjin Children’s Hospital from August 2008 to July 2009.The viral RNA was amplified by a reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The amplified genes were sequenced and compared with the NV sequences deposited in GeneBank.The sequence homology was evaluated and the phylogenetic tree was generated by DNAstar and Bioedit software.Results:One hundred and seventy-four positive samples of NV were detected in 540 specimens.The positive rate was 32.22%.There was a higher NV positive rate(62.22%)in November 2008.Seven NV positive samples were selected and sequenced,showing that NV strains all belonged to GⅡ-4.Conclusion:Norovirus is one of the important diarrhea pathogens of viral gastroenteritis in infants and young children in Tianjin area and the GⅡ-4 is the major prevalent strain.

diarrhea,infantile genotype reverse transcriptase polymerase chain reaction caliciviridae sequence analysis TIANJIN

300074 天津市兒童醫院（王瑞雪，彭林）；天津市兒童醫院兒研所（林書祥，王維）

△通訊作者 E-mail：lpengfch@yahoo.com

（致謝：本次研究得到了天津市兒童醫院兒研所及預防科各位老師的大力支持，特此表示由衷的感謝）

（2010-02-02收稿 2010-04-22修回）

（本文編輯 閆娟）

短篇與病例報告