Rv2653c在大腸埃希菌中的克隆與表達研究

李邦印 孫衛國 程小星 孫昌文 熊志紅 王仲元 王金河 蘇銳

(解放軍第309醫院結核病研究室 北京 100091)

結核病是由結核分枝桿菌(M ycobacterium tuberculosis)所致的以呼吸道為主的慢性傳染病,是目前危害全球人類健康的主要傳染病之一。全世界每年約有(800～1 000)萬新發結核病例。結核病疫情有日益嚴重的趨勢,難于防治,主要原因之一是由于對結核病早期診斷和預防的不足。獲得攜有足夠信息的結核分枝桿菌抗原,深入研究結核菌基因的功能,從分子生物學角度重新認識結核分枝桿菌凸顯其關鍵性,并持續發掘其免疫診斷工具,變得越來越重要。差減雜交等實驗中發現 Rv2653c(類似于phiRv2)與phiRv1在部分弱毒和無毒分枝桿菌中是缺失的,且鮮有文獻對此進行專門研究[1]。2008年,我們合成了 Rv2653c引物,以 H37Rv基因組DNA為模板,用PCR方法擴增獲得了Rv2653c基因,嘗試在p ET24b載體進行了高效表達研究。本實驗為進一步研究結核菌的遺傳學特征和篩選新抗原奠定了基礎。

1 資料和方法

1.1 菌株和質粒來源 菌株:結核分枝桿菌 H37Rv株來源于生物制品檢定所;E.coli DH5α、E.coli BL 21(DE3),本室保存。質粒:表達質粒載體p ET-24b(Novagen)。臨床抗血清:5例結核病患者血清,結明實驗3項檢測結果均為強陽性結果,明確診斷為肺結核。

1.2 主要試劑 EcoRⅠ,HindⅢ,T4 DNA Lig

ase(New England Biolabs);瓊脂糖、p GEM-T vector System-Ⅰ、IPTG、X-Gal、4 ×dN TP(Promega);Plantinum Taq DNA polymerase(Invitrogen);DNA快速純化試劑(賽百盛公司);蛋白質分子量標準(Sigma);Chelating Sepharose Fast Flow蛋白純化試劑(Amersham Pharmacia);Western blo ting lum ino reagent(Santa cruz);辣根過氧化物酶標記的羊抗人 IgG(北京中山生物制品公司);引物合成和測序服務(上海生物工程公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設計 根據結核分枝桿菌基因組序列,針對RV 2653c基因設計一對引物,采用 PCR擴增的方法,以 H37Rv標準株基因組DNA為模板,擴增目的基因。直接將基因插入克隆載體p GEM-T。正義鏈引物 :5′accggaattcttgacccacaagcgcactaaac;反義鏈引物 :5′gcccaagcttctgtttgctgtcgggttcgtc;兩端分別采用EcoR I和 Hind III限制性酶切位點。

1.3.2 PCR擴增Rv2653c基因 PCR反應程序:95℃×5min;94℃×20 s,60℃×20 s,72℃×90 s,32循環;72℃延伸7min。

1.3.3 瓊脂糖電泳回收DNA片段 1.5%瓊脂糖電泳結束后,用干凈的手術刀片切下約0.5 kb DNA條帶,放入無菌的eppendrof管中,操作方法參照DNA回收試劑盒說明。

1.3.4 基因克隆與測序 PCR產物與p GEM-T連接,參照p GEM-T vecto r System-Ⅰ產品說明,克隆載體的鑒定初步采用藍白斑篩選,然后以PCR和限制性內切酶酶切的方法鑒定白斑菌落。重組子樣品質粒送往測序公司。

1.3.5 構建表達載體p ET24b-Rv2與鑒定 EcoRⅠ和 HindⅢ限制性內切酶從p GEM-Rv2切下約0.5 kb大小的基因片段與經過同樣雙酶切的p ET24b的進行快速連接,然后轉化DH5α,克隆篩選與鑒定具體方法均參照《分子克隆實驗指南》。將p ET24b-Rv2重組質粒重新測序。

1.3.6 重組蛋白的表達及其產物鑒定 (1)誘導表達:分別將p ET24b-Rv2陽性克隆質粒轉染BL21(DE3),挑單克隆轉種于5m l含50μg/m l卡那霉素的LB培養液中,37℃恒溫振蕩器培養過夜,然后以0.5%的比例轉接到200 m l含50μg/m l卡那霉素的LB培養液,37℃培養至OD600值約0.8～1.0時,加入 IPTG至終濃度為0.1 mmol/L,誘導 4～5 h。取出 ,冰浴 30min,離心 4 000 rpm ×10min,收集菌體,用 SDS-PAGE電泳方法鑒定表達產物。(2)純化重組蛋白末端攜6個組氨酸,可通過形成配位鍵而與金屬螯合親和層析柱上固定化的某些二價金屬離子(如鎳)結合。試劑及純化方法參照純化試劑盒的操作按說明書進行。收集純化蛋白,用PEG濃縮后再透析,采用Low ry法定量蛋白濃度。1.3.7 重組蛋白抗原性分析 取純化蛋白進行SDS-PAGE,轉PVDF膜,然后以5例臨床結核患者血清多抗進行Western blot,采用辣根過氧化物酶標記的羊抗人 IgG作為二抗,初步分析rRv2653c的特異性。Western blot實驗操作參照《分子克隆實驗指南》和化學發光試劑盒說明進行。

2 結果

2.1 釣取 Rv2653c基因 以 H37Rv基因組DNA為模板,進行 PCR擴增獲得了大小約為0.5 kb的DNA片段。

2.2 Rv2653c的克隆與鑒定

2.2.1 克隆與 PCR擴增鑒定 由結核菌基因組DNA擴增來的PCR片段經純化后直接與p GEM-T連接、轉化,挑選單克隆菌落快速提取質粒,以此為模板,采用Rv2653c上、下游引物進行PCR擴增;鑒定結果見圖1。陽性重組子命名為p GEM-Rv2。

2.2.2 酶切鑒定 取重組質粒5μl,用 EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切2 h;1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,重組質粒可以切下約0.5 kb的片段見圖1。

2.2.3 序列測定 陽性重組子經測定序列如下:與報道的序列一致。

圖1 p GEM-Rv2重組子鑒定

圖2 圖2 p ET24B-Rv2重組子鑒定

2.3 構建重組表達載體及其重組蛋白的表達和純化

2.3.1 重組表達質粒的鑒定 采用 EcoR Ⅰ和HindⅢ雙酶切方法鑒定重組子(圖2)。發現均可以得到大小約為0.5 kb的DNA片段,重組子命名為p ET24b-Rv2,重新測定序列,見圖3。序列符合預期。

2.3.2 重組蛋白的誘導表達與純化 p ET24b-Rv2重組質粒轉化BL 21(DE3),用 IPTG誘導表達,收集菌體,用 SDS-PA GE電泳鑒定表達產物,發現重組蛋白產量約占菌體總蛋白的20%左右。采用Chelating Sepharose Fast Flow純化融合蛋白,最后得到的重組蛋白產品純度可以達到90%以上(圖4)。

圖3 p ET24b-Rv2重組子基因序列

圖4 p ET24b-Rv2重組蛋白的表達與純化電泳鑒定圖譜

2.3.3 重組蛋白抗原性分析 對純化的融合蛋白進行Western blot分析,結果見圖5。結果顯示:重組蛋白與與結核患者血清有較強的反應性,有抗原性。

圖5 重組蛋白的western blot分析

3 討論

結核分枝桿菌基因組的遺傳學演化史就是微生物適應微環境,與時俱進的歷史,結核菌不斷演化、進化,以適應外環境和人們對結核病的處置方式。部分結核菌菌株測序工作完成后,人們發現結核菌基因組中有很多外來基因,這些基因可能在結核菌的不同生活時期扮演著不同的角色。

Rv2653c是我們在強毒菌株與弱毒株間進行差減雜交分析得到的1個基因,基因組大小約10 kb,編碼107個氨基酸,其富含脯氨酸,與前噬菌體蛋白phiRv1和phiRv2序列有類似性,其蛋白結構與其他細菌中噬菌體包裝相關蛋白類似[2-5],它們在致病性結核菌如M TB、牛型分枝桿菌等中存在,而在非致病的卡介苗等弱毒株的基因組中丟失,有一定的遺傳學研究價值,相關文獻很少。它們在致病菌中出現而在非(弱)致病菌中缺失的表現非同尋常,值得我們進一步去探索它在結核菌中的功能。目前該蛋白市場上有商品化的國外重組產品,而國內沒有相關的研究。

本研究在大腸埃希菌中高效表達Rv2653c基因,獲得了高效表達的工程菌株,得到純度達到90%以上的重組蛋白。Western blot分析發現,重組蛋白與結核病患者血清反應強烈,這充分說明該重組蛋白的抗原性很好。拋開其遺傳學的角色概念,該蛋白可能還是一種潛在的診斷用抗原,該蛋白的免疫原性為其血清學檢測指示了另外的研究方向。

未來,我們將一方面利用現有的重組蛋白做一些有關其遺傳學角色的工作,闡述其在結核菌中的功能;另一方面,我們將進行血清學特異性分析,并嘗試作為若干抗原成分之一,開展Elispot等方面的實驗,探討其是否可作為一種候選的診斷用抗原。

[1]熊志紅,莊玉輝,李國利.差顯技術分析結核桿菌 H37Rv與H37Ra差異表達的基因[J].微生物學通報,2005,3(2):57-61.

[2]Bibb LA,Hancox M I,Hatfull GF.Integration and excision by the large serine recombinase phiRv1 integrase[J].Mol Microbiol.2005,55(6):1896-1910.

[3]Bogun AG,Anisimova VA,Stepanshina VN,Shemiakin IG.Structure of deletions detected in the genomes of clinical M ycobacterium tuberculosis strains[J].Probl Tuberk Bolezn Legk,2007,(12):42-47.

[4]Bibb LA,Hatfull GF.Integration and excision of the M ycobacterium tuberculosis p rophage-like element,phiRv1[J].Mol M icrobiol.2002,45(6):1515-1526.

[5]Hendrix RW,Smith MC,Burns RN,Ford M E,Hatfull GF.Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and p rophages:all the world’s a phage[J].Proc Natl Acad Sci U S A.1999,96(5):2192-2197.