多指標(biāo)優(yōu)選醒目顆粒水提醇沉制備工藝

玄律，倪健

(1.北京市海淀區(qū)北太平莊醫(yī)院藥劑科，北京100082;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥系，北京100102)

視網(wǎng)膜病變是糖尿病嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其病變表現(xiàn)為微血管瘤形成、出血、水腫、滲出等眼底的改變，導(dǎo)致視網(wǎng)膜水腫，黃斑囊樣水腫，視網(wǎng)膜出血，以及毛細(xì)血管閉塞和新生血管形成。醒目顆粒中含有枸杞子、丹參、石斛、三七、牡丹皮等藥材，諸藥合用，共湊清熱利濕，滋補(bǔ)肝腎，活血明目之功效，適用于糖尿病視網(wǎng)膜病變濕熱內(nèi)蘊(yùn)，肝腎陰虛，瘀血阻滯證。

因本處方中藥味較多，有效成分較復(fù)雜，為最大限度的提取藥物有效成分，充分發(fā)揮中藥復(fù)方的功效，故在提取工藝上分別采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性成分、乙醇回流提取和水煎煮提取，水提液濃縮后，加乙醇沉淀，最后制粒。本文旨在通過多指標(biāo)控制優(yōu)選醒目顆粒水提醇沉的最佳工藝。

1 儀器與試藥

藥材(市售)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定符合2005版中國(guó)藥典項(xiàng)下規(guī)定;甜菜堿對(duì)照品(110894200503)和丹酚酸B對(duì)照品(111562-200807)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;色譜柱:Diamonsil C18(5 μm 250 mm×4.6 mm);島津SPD-10Av高效液相色譜儀。雙波長(zhǎng)薄層掃描儀(cs-9000 SHIMADZU)，甲醇、乙腈為色譜純，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 制備工藝考察

2.1 水提工藝優(yōu)選

2.1.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)處方中藥材有效成分多為水溶性，為提高提取效率，采用諸藥合并水煎煮提取法。通過預(yù)試驗(yàn)研究和參考相關(guān)文獻(xiàn)［1-4］，以加水倍量(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)3個(gè)因素作為考察對(duì)象，以甜菜堿和丹酚酸B提取率綜合指標(biāo)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9(3)4表進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平安排見表1。

表1 因素水平表

2.1.2 試驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)按處方比例稱取枸杞子、丹參等藥材9份，按上述因素水平表采用L9(3)4正交表進(jìn)行水煎煮提取，提取液濾過、濃縮，干燥，得干浸膏，分別測(cè)定其中甜菜堿和丹酚酸B提取率。試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2、表3可見，各因素均無顯著影響，對(duì)藥材有效成分提取率的影響程度依次為加水倍量(A)>提取次數(shù)(C)>提取時(shí)間(B)，直觀分析水提最佳工藝為A2B2C2，即10倍量水，煎煮2次，每次1.5 h。

2.1.3 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)按處方比例取藥材2份，按最佳工藝條件提取，測(cè)定甜菜堿和丹酚酸B提取率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定，甜菜堿及丹酚酸B的提取率較高。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

表4 水提工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 醇沉工藝優(yōu)選

醇沉工藝主要受到提取液相對(duì)密度和醇濃度的影響，故本試驗(yàn)把兩者作為考察因素。分別按處方比例稱取藥材3份，按水提最佳工藝進(jìn)行提取，提取液分別濃縮至相對(duì)密度1.00～1.05、1.05～1.10、1.10～1.15(60℃)，再將各相對(duì)密度下的提取濃縮液各分3份，每份分別加乙醇至含醇量達(dá)50%、60%和70%，靜置24 h，回收乙醇，濃縮，干燥，得干膏粉，測(cè)定其甜菜堿和丹酚酸B轉(zhuǎn)移率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

由表5可以看出，當(dāng)藥材提取液濃縮至相對(duì)密度1.05～1.10，加乙醇至含醇量達(dá)50%時(shí)，綜合指標(biāo)最高，且甜菜

堿及丹酚酸B轉(zhuǎn)移率均較高，所以確定醇沉最佳工藝為:藥材提取液濃縮至相對(duì)密度1.05～1.10(60℃)，加乙醇至含醇量達(dá)50%。

表5 醇沉工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 含量測(cè)定

3.1 甜菜堿含量測(cè)定

3.1.1 薄層色譜條件同中國(guó)藥典一部，枸杞子［含量測(cè)定］項(xiàng)下操作。

3.1.2 供試品溶液的制備同中國(guó)藥典一部，枸杞子［含量測(cè)定］項(xiàng)下操作。

3.1.3 藥材供試品溶液的制備同3.1.2項(xiàng)下操作。

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取上述對(duì)照品溶液2、3、4、5、6 μL點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，按3.1.1項(xiàng)下操作，以點(diǎn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=925.91X+9 022.3，r=0.996 1。結(jié)果甜菜堿在8.06～24.18 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.5 藥材中甜菜堿的含量測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液1 μL和4 μL，藥材供試品溶液3 μL，其余同3.1.3項(xiàng)下操作。以線性回歸兩點(diǎn)法計(jì)算，得本批枸杞子藥材中甜菜堿的含量為0.64%。

3.1.6 供試品溶液中甜菜堿含量測(cè)定分別精密吸取對(duì)照品溶液1 μL和4 μL，供試品溶液4 μL交叉點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，其余操作同3.1.3項(xiàng)下操作。以線性回歸兩點(diǎn)法計(jì)算。

3.2 丹酚酸B的含量測(cè)定

3.2.1 高效液相色譜條件色譜柱:Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:(甲醇-乙腈)-(甲酸-水)=(30∶15)∶(1∶59)=43∶57;檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm;流速1 mL/min。此條件下，峰形較好。

3.2.2 對(duì)照品溶液的配制精密稱定丹酚酸B對(duì)照品2.8 mg，置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度;精密吸取該對(duì)照品溶液5 mL置10 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.2.3 供試品溶液的制備精密稱取干膏粉適量(約相當(dāng)于丹參生藥材0.2 g)，余同中國(guó)藥典一部，丹參［含量測(cè)定］項(xiàng)下操作。

3.2.4 藥材供試品溶液的配制精密稱取丹參藥材粉末(過三號(hào)篩)0.207 4 g，其余同中國(guó)藥典一部，丹參［含量測(cè)定］項(xiàng)下操作。

3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取上述丹酚酸B對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 μL注入高效液相色譜儀中測(cè)定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程Y=921 060X－8 241.1，r=0.999 6。結(jié)果丹酚酸B在0.28～1.4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.6 藥材供試品中丹酚酸B含量測(cè)定精密吸取藥材供試品溶液8 μL注入高效液相色譜儀中，按3.2.1項(xiàng)下條件操作，按回歸方程計(jì)算。測(cè)得本批丹參藥材中丹酚酸B含量為3.46%。

3.2.7 供試品中丹酚酸B含量測(cè)定精密吸取供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀中，按3.2.1項(xiàng)下條件操作。按回歸方程計(jì)算。

4 討論

4.1 處方中藥味較多，各味藥中所含有效成分的理化性質(zhì)不同，單純采用一個(gè)指標(biāo)不易于控制制劑質(zhì)量，由于枸杞子為君藥，丹參中有效成分丹酚酸B不穩(wěn)定易分解，故以甜菜堿和丹酚酸B為考察指標(biāo)，進(jìn)一步保證了復(fù)方制劑的質(zhì)量，優(yōu)選出更為合理的水提醇沉工藝。

4.2 在水提工藝中，如果將兩者的權(quán)重改為甜菜堿-丹酚酸B=0.7∶0.3，則統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異。雖然枸杞子為方中君藥，丹參為方中佐藥，但是兩者在方中的用量是相等的，所以將兩者的權(quán)重定為甜菜堿-丹酚酸B=0.5∶0.5更能反應(yīng)原方的用藥目的，更合理。

4.3 在水提工藝中，無論是分別以甜菜堿和丹酚酸B為指標(biāo)，還是以兩者為指標(biāo)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均沒有差異。考慮可能是由于所選因素水平范圍較窄，將提取時(shí)間縮短到0.5 h，延長(zhǎng)至2.5 h，或是將加水倍量分別增加至14倍量或減少至6倍量，經(jīng)分析則有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是，本文所選擇的因素水平為工業(yè)生產(chǎn)常用，單純?yōu)楂@得統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而做的因素水平的調(diào)整，在工業(yè)大生產(chǎn)中并不可行。故雖本文所選因素水平未能做出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但對(duì)工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)同樣具有指導(dǎo)意義。

4.4 本文僅對(duì)醒目顆粒水提醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)選，其余醇提和水蒸氣蒸餾提取部分有待于進(jìn)一步研究。

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