99Tcm標記的PEG4/2PEG4修飾的環狀RGD二聚體體內外性質的對比

靳存敬，史繼云，劉 妍，靳曉娜，黃金銘，趙慧云，李 方，王 凡，*

1.北京大學 醫學同位素研究中心，北京 100191；2.北京協和醫院 核醫學科，北京 100730

實體腫瘤生長過程中的一個重要環節是新生血管生成(angiogenesis)[1]。在諸多針對血管為靶點的腫瘤治療中，整合素(integrin)αvβ3受到廣泛的關注，它在腫瘤組織新生血管內皮細胞表面和多種惡性腫瘤細胞表面高表達，而在成熟血管內皮細胞和絕大多數正常組織器官不表達或表達很低，并且在新生血管內皮細胞的粘附、遷移、生長、分化過程中發揮重要作用[2-4]。整合素αvβ3能識別配體分子中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列，因此為設計含有RGD序列的多肽藥物用于整合素αvβ3陽性腫瘤的檢測和治療提供了理論基礎[5-6]。

放射性核素標記的RGD多肽已廣泛用于腫瘤的顯像和治療研究[7-8]。為了增加RGD多肽與整合素αvβ3的親和力，人們將“多聚化”的概念引入到RGD多肽放射性藥物的研究中[9-10]。另外，為了改善放射性藥物的體內藥代動力學性質，人們對標記藥物進行修飾，包括糖基化、引入水溶性的氨基酸和聚乙二醇(PEG)[7]。本實驗室在前期研究中也對有關RGD多肽多聚化以及結構修飾方面的工作進行了報道[11-16]。

本研究以HYNIC為雙功能螯合劑，用99Tcm標記PEG4修飾的2種RGD二聚體衍生物：在2個RGD模序(motif)間引入2個PEG4分子；在RGD二聚體與HYNIC雙功能螯合劑間引入1個PEG4分子(圖1)，比較在不同部位引入PEG4分子對受體配體親和力的影響，以及對標記藥物的藥代動力學性質的影響，并對其在正常鼠體內的生物分布進行評價。

圖1 RGD環肽二聚體及其衍生物的分子結構Fig.1 Structure of cyclic RGD dimer and its derivatives

1 實驗材料

1.1 主要試劑

Na99TcmO4，北京原子高科核技術股份有限公司；HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer，結構示于圖1，美國Purdue大學劉爽教授饋贈；三羥甲基甘氨酸(Tricine，N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]glycine)、三苯基膦三間磺酸鈉(TPPTS，trisodium triphenylphosphine-3,3′,3″-trisulfonate)，美國SIGMA公司；丙酮、乙腈、醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸等，分析純，北京試劑公司；快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG)，美國Gelman公司。96孔細胞抽濾板，美國Millipore公司。

1.2 儀器

CRC-15R放射性活度計，美國Capintec公司；1470-002全自動γ計數儀，美國Perkin Elmer公司；AR-2000 放射性薄層掃描儀，美國Bioscan公司；HP1100高效液相色譜(帶有Berthold公司的LB-509放射性檢測器)，美國安捷倫公司；Agilent Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國安捷倫公司。

1.3 實驗動物

ICR小白鼠，雌性，約25 g，二級，購自北京大學醫學部實驗動物部。

2 實驗方法

2.1 3種標記化合物的制備

在Eppendorf(EP)管中加入6.50 mg Tricine、5.00 mg TPPTS、20 μL HYNIC偶聯的不同的RGD多肽(HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer)(1 g/L)、100 μL琥珀酸緩沖溶液(pH=5.0，25 mmol/L)，最后加入100 μL Na99TcmO4(約74 MBq)，混勻，100 ℃反應20 min，取樣進行ITLC和HPLC分析。注射前用Sep-Pak C18小柱對標記物進行純化，并過0.22 μm濾膜。

2.2 質量控制方法

2.2.1薄層層析法(ITLC) 將標記物點樣于ITLC濾紙上，于丙酮展開體系中上行展開，用放射性薄層掃描儀進行掃描，計算標記率和放化純度。

2.2.2HPLC法 使用LabAlliance HPLC系統，配備放射性在線檢測器和Zorbax C18分析柱(4.6 mm×250 mm,30 nm pore size)，梯度淋洗30 min，流速1.0 mL/min，其中流動相A為醋酸氨緩沖液(NH4OAc，0.025 mol/L，pH=5.0)，B為乙腈，流速為1.0 mL/min，淋洗梯度設定為起始至2 min時90% A和10% B，5 min時85% A和15% B，15 min時80% A和20% B，20—25 min時50% A和50% B，26—30 min回到基線梯度90% A和10% B。

2.3 脂水分配系數的測定

將100 μL標記物加入到含有400 μL磷酸緩沖溶液(PB，pH=7.4，0.05 mol/L)和500 μL正辛醇的EP管中，蝸旋4 h后在8 000 r/min 條件下離心10 min，取等體積有機相和水相測量放射性計數，計算標記物的脂水分配系數P(有機相計數/水相計數)及lgP。

2.4 競爭結合實驗

采用Iodogen方法制備125I-c(RGDyK)，比活度約為3.7×1013Bq/mmol。U87MG人神經膠質瘤細胞用含10%胎牛血清的DMEM(低糖)培養液在37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養傳代。參考Chen[17]的方法，制細胞懸液，并按每孔105個細胞鋪于Multiscreen 96孔抽慮板上，加入約2×105/min的125I-c(RGDyK)以及濃度依次遞升的3種RGD多肽(0～1 000 nmol/L)，用結合緩沖液(pH=7.4，500 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L MnCl2和w=1%的牛血清白蛋白)將反應體積調節到200 μL，4 ℃孵育2 h，洗去未結合的125I-c(RGDyK)，收集濾膜并在γ計數儀上進行測量，用GraphPad Prism 4.0(GraphPad軟件,SanDiego,CA)軟件進行擬合，非線性回歸分析計算半數抑制濃度IC50。

2.5 動物實驗

2.5.1標記物的藥代動力學 選取21只ICR小白鼠，隨機分成3組，每組7只。經尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標記物，于注射后1、3、5、7、10、15、20、30、60、120 min取尾靜脈血，稱重并測量放射性計數，經衰變校正后計算每毫升血液的百分注射劑量率Dinj(%ID/mL)，繪制血液清除曲線。

2.5.2標記物在正常小鼠體內的生物分布 將36只ICR小白鼠隨機分成3組，每組12只，分別經尾靜脈注射100 μL(約370 kBq)3種不同標記物，于注射后0.5、1、4 h按組(每組4只)將實驗小鼠處死，取血及主要臟器，稱重并測量放射性計數，經衰變校正后計算每克組織的百分注射劑量率(%ID/g)。

2.6 統計學分析

使用Prism 4.0軟件對實驗數據進行分析，P<0.05為有顯著性差異。

3 結果和討論

3.1 標記物的制備及質控

在ITLC分析方法中，標記化合物的Rf=0.0～0.1，游離99Tcm的Rf=0.9～1.0。實驗結果表明，3種標記化合物的標記率均達到98%以上。本研究采用TPPTS作為協同配體，它同時具有還原作用，因此在標記過程中不用加入氯化亞錫，這樣可以防止锝膠體的生成。

純化后3種標記物的HPLC分析結果示于圖2。由圖2可以看出,99Tcm-HYNIC-RGD dimer的保留時間為10.64 min，99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的保留時間為10.53 min,99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的保留時間為11.53 min(游離99Tcm的保留時間約為3 min)，3種標記物的放射化學純度均大于99%。

圖2 3種99Tcm標記物的放射性HPLC圖譜Fig.2 Radio-HPLC chromatogram of three 99Tcm-labeled compounds

3.2 脂水分配系數

化合物的脂水分配系數可以用于評價標記物的水溶性，脂水分配系數越大說明標記物的脂溶性越好。99Tcm-HYNIC-RGD dimer，99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer和99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的lgP分別為-2.24±0.01(n=3)，-2.78±0.04(n=3),-2.52±0.02(n=3)。結果表明，PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。

3.3 競爭結合研究

通過c(RGDyK)、HYNIC-RGD dimer、HYNIC-PEG4-RGD dimer和HYNIC-2PEG4-RGD dimer競爭125I-c(RGDyK)與U87MG細胞表面整合素αvβ3的結合，比較了4種配體對整合素αvβ3的親和力(圖3)，它們的IC50值分別為37.29±5.00、8.43±0.62、7.53±0.51、2.90±0.31 nmol/L。IC50值越小，表明親和力越強。HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力約為HYNIC-RGD dimer的2.5倍，約為RGD單體的12倍。HYNIC-PEG4-RGD dimer與HYNIC-RGD dimer相比，親和力無顯著差異。HYNIC-2PEG4-RGD dimer是在2個RGD模序(motif)之間引入2個PEG4分子，從而2個RGD模序之間的距離從6個化學鍵長增加到38個化學鍵長，這樣2個RGD分子可以同時與細胞表面2個相鄰的整合素αvβ3受體相結合，增強了結合的親和力。這與Wang等[18]的研究結果相一致。HYNIC-PEG4-RGD dimer是在RGD多肽與雙功能螯合劑HYNIC之間引入1個PEG4分子，沒有改變2個RGD模序之間的距離，因此其與整合素αvβ3的親和力沒有明顯改變。

圖3 受體競爭結合實驗結果Fig.3 Receptor competitive binding assay■——c(RGDyK)，▼——HYNIC-RGD dimer,◆——HYNIC-PEG4-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

3.4 動物實驗

3.4.1藥代動力學研究 3種標記物在正常小鼠體內的血液清除實驗結果示于圖4。從圖4可以看出，3者均符合二室代謝模型，其中99Tcm-HYNIC-RGD dimer的分布相為0.76 min，消除相為17.10 min；99Tcm-HYNIC-PEG4-RGD dimer的分布相為0.72 min，消除相為24.23 min；99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer的分布相為0.62 min，消除相為14.39 min。3種標記物的藥代動力學性質相似，并都符合多肽類藥物分布清除快的特點。

圖4 3種99Tcm標記物的血液清除曲線Fig.4 Blood clearance of three 99Tcm-labeled compounds▲——HYNIC-PEG4-RGD dimer,■——HYNIC-RGD dimer,●——HYNIC-2PEG4-RGD dimer

3.4.2藥物在正常鼠體內的生物分布 3種標記物在正常小鼠體內的生物分布數據列于表1。從表1可以看到，注射后0.5 h99Tcm-HYNIC-

PEG4-RGD dimer((17.61±1.87)%ID/g)在腎的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((13.85±1.91)%ID/g,P<0.05)，其余臟器各標記物組別間沒有差異，這表明PEG4作為藥代動力學修飾分子增強了標記物的親水性，從而增強了其從腎臟的排泄；注射后4 h腸對99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer((4.01±0.90)%ID/g)的攝取高于99Tcm-HYNIC-RGD dimer((2.12±0.71)%ID/g，P<0.05)，我們考慮這是否是由于腸中有整合素αvβ3的表達，2個PEG4的引入明顯提高了配體受體的親和力，從而增加了腸的攝取，這需要通過Western Blot實驗進一步驗證；腎對99Tcm-HYNIC-RGD dimer的攝取低于其余2種標記物，這與脂水分配系數測定結果相一致，PEG4的引入使2種衍生物的水溶性有所增加。

表1 3種99Tcm標記物的正常鼠生物分布Table 1 Biodistribution of three 99Tcm-labeled compounds in normal mice

注(Note)：n=4

4 結 論

在本研究中，3種99Tcm標記的RGD二聚體在所用標記條件下均獲得大于98%的標記率；競爭結合實驗結果表明，HYNIC-2PEG4-RGD dimer與整合素αvβ3的親和力明顯高于其它2種化合物；藥代動力學的實驗結果驗證了3種多肽類藥物的代謝特點，均有較快的分布相和消除相；正常鼠體內生物分布結果表明，PEG4的引入增強了標記物的水溶性。99Tcm-HYNIC-2PEG4-RGD dimer具有更好的體內外性質，作為一種潛在的腫瘤顯像劑，具有進一步研究開發的價值。

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