123I和99Tcm標記的吲哚類σ2受體放射性示蹤劑的設計、穩定化合物的合成及體外生物評價

李 艷，賈紅梅,*，Deuther-Conrad Winnie，Brust Peter，Steinbach Joerg，劉伯里

1.放射性藥物教育部重點實驗室，北京師范大學 化學學院，北京 100875;2.Forschungszentrum Dresden-Rossendorf, Institute of Radiopharmacy/Neuroradiopharmaceutical Division, 04318 Leipzig, Germany

目前，惡性腫瘤在我國已成為危害人們健康的頭號殺手。乳腺癌、前列腺癌、肺癌等呈逐年上升趨勢。研究表明，σ受體在許多腫瘤細胞系中有高度表達[1]，在腫瘤診斷和治療方面有廣泛的應用[2]。目前σ受體至少有兩種亞型被確認：σ1型和σ2型受體[3]。其中，σ2受體是腫瘤增殖的生物標志[4-6]。

圖1 吲哚類化合物的結構Fig.1 Structure of the Indole compounds

Mach等[7]認為，用于固體瘤增殖期顯像的PET放射性示蹤劑主要有兩種：一是放射性核素標記的核酸類似物(DNA前體)，如[18F]FLT等，但該類顯像劑的缺點是只能標記處于增殖期的部分腫瘤細胞，常常低估腫瘤增殖狀態；另一種就是放射性核素標記的σ2受體示蹤劑，該類顯像劑可以標記所有腫瘤細胞，可以更好地估計腫瘤增殖狀態。因此，與σ2受體有高親和力和選擇性的放射性示蹤劑是優良的腫瘤顯像劑，其研究具有重要的理論意義和實際應用價值[8]。Perregaard 等[9]報道了一系列對σ2受體具有較高親和力和選擇性的吲哚類化合物，該類代表化合物的結構示意圖示于圖1，IC50值列入表1。為了設計吲哚類腫瘤SPECT顯像劑，首先在與哌嗪環相連的苯環對位引入碘原子，設計123I標記的吲哚類化合物。由于99Tcm核素優良的核性質及便宜易得等優點，保留可能是配體與σ2受體作用的藥效團吲哚環部分，將99Tcm-MAMA螯合基團取代哌嗪環，采用整體法設計99Tcm標記的配合物。在此基礎上，合成其穩定化合物 (Indole-I和Indole-MAMA-Re)并進行體外生物評價。制備了標記前體(Indole-MAMA)和99Tcm-Indole-MAMA，為設計合成用于SPECT顯像的123I和99Tcm標記的吲哚類σ2受體腫瘤顯像劑提供了參考。

表1 吲哚類化合物的IC50值Table 1 IC50 values of indole compounds

1 實驗部分

1.1 主要試劑、材料和儀器

吲哚丁酸、氟哌啶醇，分析純，美國Aldrich公司；對氟碘苯、N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，分析純，比利時Acros公司；氧化鋅、碘化亞銅，分析純，三苯基磷，化學純，北京國藥集團化學試劑公司；三氟乙酸，化學純，美國Alfa公司；氫化鋁鋰、甲基吡咯烷酮、溴代琥珀酰亞胺，化學純，三乙胺、無水碳酸鉀，分析純，北京化工廠；三乙基硅烷，化學純，北京金龍化學試劑有限公司；苯甲醚，化學純，北京市東環聯合化工廠；[3H]鎮痛新，1 354 GBq/mmol，美國Perkin Elmer Life Sciences；[3H]DTG，1 147 GBq/mmol，美國NEN Life Science Products；烯丙右嗎喃氫溴酸鹽(Dextrallorphan hydrobromide)，獲贈于Hoffman-La Roche, Basel, Switzerland；99Mo-99Tcm發生器由中國原子能科學研究院提供。

AVATAR 360型紅外譜儀，美國Nicolet公司；Avance 500 MHz型核磁共振譜儀，Avance Ⅲ 400 MHz型核磁共振譜儀，均為瑞士Bruker公司；GC2000/TRACETMMS 質譜儀，美國Finigan公司；240C 型元素分析儀，美國Perkin-Elmer公司；SCL-10AVP高效液相色譜儀，日本島津公司；Alltima C18反相柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)，美國Alltech公司；Class-Packard 500 TR系列的放射性檢測器，美國Packard Bioscience公司。

1.2 Indole-I和Indole-MAMA-Re的合成

1.2.11-(4-氟苯)-3-(4-(4-(4-碘苯)哌嗪-1-)丁基)-1H-吲哚(Indole-I)的合成 Indole-I的合成路線示于圖2。4-(1-(4-氟苯)-1H-吲哚-3-)丁醇(化合物1)的合成參考文獻[9]。化合物1與N-溴代丁二酰亞胺(NBS)、Ph3P反應生成3-(4-溴丁基)-1-(4-氟苯)-1H-吲哚 (化合物2)，化合物2與1-(4-碘苯)哌嗪反應生成1-(4-氟苯)-3-(4-(4-(4-碘苯)哌嗪-1-)丁基)-1H-吲哚(化合物3)。

圖2 Indole-I的合成路線Fig.2 Synthetic route of Indole-I

(1) 3-(4-溴丁基)-1-(4-氟苯)-1H-吲哚(化合物2)的合成

將150 mg化合物1(0.53 mmol)、Ph3P 170 mg(0.64 mmol)、NBS 110 mg(0.63 mmol)溶于3 mL THF中，在冰浴條件下攪拌2 h，過濾后旋去溶劑，過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶10。化合物2的產率為82%。

(2) 1-(4-氟苯)-3-(4-(4-(4-碘苯)哌嗪-1-)丁基)-1H-吲哚(化合物3)的合成

將100 mg化合物2(0.29 mmol)、80 mg 1-(4-碘苯)哌嗪(0.77 mmol)、400 mg K2CO3(2.9 mmol)、50 mg KI(0.29 mmol)溶于10 mL乙腈中，加熱到80 ℃，回流6 h。過濾，旋去溶劑后過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶4。化合物3的產率為68%。

1.2.2Indole-MAMA-Re的合成 Indole-MAMA-Re的合成路線示于圖3。化合物2與螯合基團反應生成Indole-MAMA-Tr(化合物4)，后經脫保護反應生成Indole-MAMA(化合物5)，再與Re螯合生成Indole-MAMA-Re(化合物6)。

(1) Indole-MAMA-Tr(化合物4) 的合成

將100 mg化合物2(0.29 mmol)溶于2 mL干乙腈中，加入208 mg MAMA-Tr(0.44 mmol)、65 mgN,N-二異丙基乙胺(DIEA)，N2保護下，加熱到80 ℃回流12 h，旋干混合物，過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶1。化合物4的產率為27%。

(2) Indole- MAMA(化合物5)的合成

冰鹽浴下，將70 mg化合物4(0.1 mmol)溶于8 mL CF3COOH中，加入0.25 mL苯甲醚，反應15 min后，加入0.2 mL三乙基硅烷，再反應20 min，溶液變為白色混濁液，旋干混合物，油泵抽干。產物未經純化直接進行下步反應。

(3) Indole-MAMA-Re(化合物6)的合成

將上步的反應產物5，在N2保護下，溶于9 mL甲醇中，加入50 mg(Ph3P)2ReOCl3(0.060 mmol)和1.5 mL NaAc/CH3OH (1 mol/L)，緩慢升溫至80 ℃，回流6 h，用乙酸乙酯稀釋反應混合物，過濾，再用乙酸乙酯洗2次，過濾，得到紫色濾液，旋干后，過柱分離，展開劑為乙酸乙酯和石油醚的混合溶液，體積比為1∶1。化合物6的產率為20%。

圖3 Indole-MAMA-Re的合成路線Fig.3 Synthetic route of Indole-MAMA-Re

1.3 化合物的受體結合分析實驗

1.3.1σ1和σ2受體的制備 Indole-I和Indole-MAMA-Re對σ1受體和σ2受體的親和力在富含各自σ受體亞型的組織中測定[10]:分別在大鼠腦組織勻漿和在大鼠肝組織勻漿中進行。動物的使用遵循德國實驗動物法和實驗室動物使用法規。σ1和σ2受體的制備方法與文獻[11]方法相同。

1.3.2Indole-I和Indole-MAMA-Re與σ1受體和σ2受體親和力的測定 Indole-I和Indole-MAMA-Re 的體外親和力用競爭結合分析法測定，方法與文獻[11]一致。簡言之，對σ1受體的親和力用大鼠腦皮質膜蛋白和0.8 nmol/L[3H]鎮痛新進行測定，對σ2受體的親和力用大鼠肝膜蛋白和0.8 nmol/L [3H]DTG在10 μmol/L 烯丙右嗎喃存在下以封閉σ1受體的條件下進行測定。膜蛋白在冰上解凍后，用培養緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4，21 ℃)稀釋，再次勻漿。實驗的蛋白濃度用二喹啉甲酸(BCA)方法測定。非特異性結合試劑采用10 μmol/L 氟哌啶醇。待測化合物的溫育溫度和時間分別為21 ℃和120 min。所有的實驗均重復3次。用迭代非線性曲線擬合法得出參數IC50值。應用Cheng-Prusoff 方程由IC50值計算得出抑制常數(Ki)值。

(1)

c(LT)為放射性配體的濃度，Kd為放射性配體與受體結合的平衡解離常數。

1.4 99Tcm-Indole-MAMA的放射化學合成及純化

1.4.199Tcm-Indole-MAMA的合成 將2 mg配體5溶于2 mL乙醇中，形成1 g/L配體溶液。取200 μL99Tcm-GH，加入100 μL配體溶液，調節pH=5.5～6.0，在80～90 ℃的水浴中加熱30 min，冷卻后，用飽和NaHCO3溶液中和至pH=7，薄層色譜法測定標記率，展開體系：生理鹽水/聚酰胺片。

1.4.299Tcm-Indole-MAMA的純化及HPLC分析 采用高效液相系統配置Packard 500 TR系列的放射性檢測器，Alltech C18反相柱，淋洗條件為梯度淋洗，流速為1 mL/min。流動相淋洗條件列入表2。

表2 流動相淋洗條件Table 2 Eluent condition of the mobile phase

注(Note):1)φ(TFA)=0.1%

2 結果與討論

2.1 中間體及目標化合物的結構鑒定

Indole-I和Indole-MAMA-Re的結構及中間體均通過IR、NMR、MS分析確證。

(1) 化合物2

IR：3 051、2 933、1 511、1 459、1 434、1 383、1 220、1 133、839、741 cm-1。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.66(d,J=9.7 Hz,1H),7.46～7.50(m,3H),7.20～7.29(m,4H),7.12(s,1H),3.50(t,J=6.6 Hz,2H),2.87(t,J=7.6 Hz,2H),2.00～2.06(m,2H),1.91～1.97(m,2H)。EI-MS:理論值，345.02;計算值，345.05。

(2) 化合物3

1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.69(d,J=7.8 Hz,1H),7.55(d,J=8.0 Hz,2H),7.47～7.50(m,3H),7.19～7.28(m,4H),7.13(s,1H),6.72(d,J=8.0 Hz,2H),3.23(brs,4H),2.88(t,J=7.2 Hz,2H),2.65(brs,4H),2.51(brs,2H),1.81～1.86(m,2H),1.72(brs,2H)。13C NMR(125 MHz,CDCl3):δ 161.8、159.8、150.8、137.8、136.3、128.9、125.9、125.1、122.5、119.8、119.3、118.1、116.5、116.3、110.2、81.4、58.5、53.0、48.6、27.9、26.7、24.9。EI-MS:理論值，553.35;計算值，553.14。

(3) 化合物4

IR：3 366、3 055、2 927、1 676、1 594、1 511、1 489、1 458、1 444、1 221、840、742、700 cm-1。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.29～7.52(m,16H),7.07～7.19(m,22H),6.91(s,1H),2.94(d,J=5.4 Hz,2H),2.77(s,2H),2.65(t,J=6.6 Hz,2H),2.31～2.32(m,2H),2.26～2.27(m,3H),2.17～2.18(m, 2H),1.59(t,J=6.8 Hz,2H),1.39～1.50(m,4H)。

(4) Indole- MAMA

產物未經純化直接進行下步的反應。

(5) Indole-MAMA-Re

1H NMR(500 MHz,CDCl3):δ 7.01～7.21(m,8H),6.80(t,1H),4.59～4.66(m,2H),4.06～4.14(m,4H),3.55～3.58(m,2H),3.36(m,2H),3.20～3.28(m,4H),1.90(m,4H)。EI-MS:理論值，659.39;計算值，659.11。

2.2 Indole-I和Indole-MAMA-Re對σ受體的親和力和選擇性

通過競爭結合曲線求得Indole-I和Indole-MAMA-Re抑制放射性配體與σ1受體或σ2受體結合一半時所需的濃度IC50值。化合物Indole-I、Indole-MAMA-Re對σ2受體的競爭結合曲線示于圖4。通過Cheng-Prusoff方程得到上述兩個化合物對σ1受體和σ2受體的抑制常數Ki值列入表3。

對于本工作研究的吲哚類化合物，在吲哚環的N原子上引入4-氟苯基，可大大提高化合物對σ2受體的親和力和選擇性[9]。而當哌嗪環相連的苯環上沒有取代基時，化合物對σ2受體的親和力(IC50=0.69 nmol/L)和選擇性(Ki(σ1)/Ki(σ2)=39)均較高，而在該苯環引入F原子后，化合物對σ1受體(IC50=440 nmol/L)和σ2受體(IC50=7.5 nmol/L)的親和力均降低，但仍保持對σ2受體的高亞型選擇性(Ki(σ1)/Ki(σ2)=59)。由表3和圖4可知，當在該苯環引入碘原子后，化合物對σ2受體(Ki(σ2)=0.162 μmol/L)的親和力和亞型選擇性(Ki(σ1)/Ki(σ2)=3.5)均降低。因此，在哌嗪環的苯環上不宜引入體積大的鹵素取代基。若用Re-MAMA螯合基團替代哌嗪環部分，化合物對σ1受體(Ki=3.75 μmol/L)、σ2受體(Ki= 7.83 μmol/L)的親和力均降低到μmol/L數量級，說明哌嗪環部分也是配體受體的重要結合位點。根據Glennon[12-13]提出的σ1和σ2受體配體的藥效團模型，σ1和σ2受體配體都應具有1個堿性氮原子和2個疏水性區域。比較Re-MAMA螯合基團與哌嗪環的結構發現，MAMA的N原子與Re原子配位后可能失去堿性N原子的特征，Re-MAMA螯合基團由于存在酰胺鍵導致脂溶性降低，也就是說，用Re-MAMA螯合基團替代哌嗪環部分后，可能影響了配體受體的2個作用位點，所以導致配體對σ1和σ2受體的親和力都大大降低。由于希望得到99Tcm標記的σ2受體顯像劑，需要降低該配合物對σ1受體的親和力，提高配合物對σ2受體的親和力，從而提高亞型選擇性，因此，利用整體法設計99Tcm標記的受體配體時，需要慎重選擇99Tcm螯合基團以及替換原配體結構的部位，破壞配體對σ1受體的作用位點，而盡量保持配體對σ2受體的作用位點，只有這樣才有可能得到對σ2受體具有高親和力和高亞型選擇性的99Tcm標記的σ2受體顯像劑。因此希望在本工作化合物的基礎上，通過進一步的結構修飾，提高化合物對σ2受體的親和力。

圖4 化合物Indole-I(a)、Indole-MAMA-Re(b)與[3H]DTG對σ2受體的競爭結合曲線Fig.4 Competition curves of [3H]DTG binding to σ2 receptors in rat liver by Indole-I(a) and Indole-MAMA-Re(b)

化合物(Compounds)Ki(σ1)/(μmol·L-1)Ki(σ2)/(μmol·L-1)Ki(σ1)/Ki(σ2)Indole?I0574±03550162±003035Indole?MAMA?Re375±222783±48705

注(Note)：n=3

2.3 99Tcm-Indole-MAMA的標記及99Tcm-Indole-MAMA與Indole-MAMA-Re的HPLC分析

99Tcm-GH的標記率大于99%,采用配體交換法制備99Tcm-Indole-MAMA的標記率為47%。經HPLC分析后，99Tcm-Indole-MAMA的放化純大于90%。純化后經HPLC分析，穩定配體Indole-MAMA-Re在C18反相柱上的保留時間為27.6 min(圖5)，標記化合物99Tcm-Indole-MAMA的保留時間為28.5 min(圖6)，兩者保留時間僅相差0.9 min，說明制備的標記物為99Tcm-Indole-MAMA。

圖5 Indole-MAMA-Re的HPLC譜圖 Fig.5 HPLC analysis of Indole-MAMA-Re

圖6 99Tcm-Indole-MAMA 的HPLC譜圖Fig.6 HPLC analysis of 99Tcm-Indole-MAMA

3 結 論

以對σ2受體具有高親和力和高亞型選擇性的1-(4-氟苯)-3-[4-(4-苯-1-哌嗪)-1-丁基]-1H-吲哚配體為先導化合物，設計了放射性碘和99Tcm標記的吲哚類σ2受體腫瘤放射性示蹤劑，合成了其穩定化合物 (Indole-I和Indole-MAMA-Re) 和標記前體(Indole-MAMA)，測定了Indole-I和Indole-MAMA-Re對σ1和σ2受體的親和力。結果表明，在哌嗪環的苯環上不宜引入體積大的鹵素取代基，在設計99Tcm標記物時，必須在保持σ2受體配體作用位點的前提下引入99Tcm螯合基團。99Tcm-Indole-MAMA與Indole-MAMA-Re的HPLC分析結果表明，制備的99Tcm-Indole-MAMA放化純大于90%。今后可在本文化合物的基礎上通過結構優化，設計合成對σ2受體具有高親和力和選擇性的吲哚類SPECT腫瘤顯像劑。

[1] Vilner B J, John C S, Bowen W D. Sigma-1 and Sigma-2 Receptors are Expressed in a Wide Variety of Human and Rodent Tumor Cell Lines[J]. Cancer Res, 1995, 55(2): 408-413.

[2] Bourrie B, Bribes E, Derocq J-M, et al. Sigma Receptor Ligands: Applications in Inflammation and Oncology[J]. Curr Opi Invest Drugs, 2004, 5: 1 158-1 163.

[3] Quirion R, Bowen W D, Itzhak Y, et al. A Proposal for the Classification of Sigma Binding Sites[J]. Trends Pharmacol Sci, 1992, 13: 85-86.

[4] Mach R H, Smith C R, Al-Nabulsi I, et al. σ2Receptors as Potential Biomarkers of Proliferation in Breast Cancer[J]. Cancer Res, 1997, 57: 156-161.

[5] Wheeler K T, Wang L-M, Wallen C A, et al. Sigma-2 Receptors as a Biomarker of Proliferation in Solid Tumours[J]. Br J Cancer, 2000, 82(6): 1 223-1 232.

[6] Al-Nabulsi I, Mach R H, Wang L-M, et al. Effect of Ploidy, Recruitment, Environmental Factors, and Tamoxifen Treatment on the Expression of Sigma-2 Receptors in Proliferating and Quiescent Tumour Cells[J]. Br J Cancer, 1999, 81(6): 925-933.

[7] Mach R H, Wheeler K T. Imaging the Proliferative Status of Tumor With PET[J]. J Label Compd Radiopharm, 2007, 50: 366-369.

[8] 張秋艷，樊彩云，賈紅梅.Sigma受體顯像劑[J].化學進展，2007,19(5):713-721.

[9] Perregaard J, Ejner K, Sanchez C, et al. σ Ligands With Subnanomolar Affinity and Preference for the σ2Binding Site. 1, 3-(ω-Aminoalky1)-1H-Indoles[J]. J Med Chem, 1995, 38: 1 998-2 008.

[10] Bowen W D. Sigma Receptors: Recent Advances and New Clinical Potentials[J]. Pharm Acta Helv, 2000, 74: 211-218.

[11] 樊彩云，賈紅梅，Deuther-Conrad W,等.新的99mTc 標記σ受體腫瘤顯像劑[J].中國科學B輯，2005，35(6):499-503.

[12] Glennon R A. Pharmacophore Identification for Sigma-1(σ1) Receptor Binding: Application of the “Deconstruction- Reconstruction-Elaboration” Approach[J]. Mini-Rev Med Chem, 2005, 5: 927-940.

[13] Glennon R A. Binding Characteristics of σ2Receptor Ligands[J]. Brazilian J Pharm Sci, 2005, 41: 1-12.