阿爾茨海默病模型小鼠自主活動能力的分析

袁樹民，張曉娟，張海濤，高 翔，高 珊，張連峰，秦 川

（中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021）

阿爾茨海默病 （Alzheimer＇s disease，AD）是發生在老年期及老年前期的一種原發性退行性腦病，患者出現一種持續性高級神經功能活動障礙，即在沒有意識障礙的狀態下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認、情緒等方面的障礙。其特征性病理變化為大腦皮層萎縮，記憶性神經元數目減少，神經元纖維纏結 （neurofibrillary tangles，NFT）、以及老年斑 （senile plaque，SP）形成［1，2］。AD患者在發病的早期（1-3年），學習新事物困難，空間定向障礙，行為上表現為淡漠，偶爾出現易激惹，在第二階段（2 -10年）患者學習記憶能力明顯下降，不能計算，有時出現失語，精神上出現妄想，運動系統表現為煩躁不安；第三階段（8-12年）患者智力嚴重衰退，運動系統表現為肢體強直，屈曲體位［3］。

在利用動物模型進行的AD研究中，主要側重學習記憶能力，空間記憶能力的測試，如水迷宮實驗，避暗實驗，多臂迷宮實驗等，目前關于阿爾茨海默病小鼠模型的自主活動能力實驗的研究很少，而主活動能力的改變是阿爾茨海默病患者的特征之一。為此，我們利用 APPswePPSΔE9雙轉基因小鼠，通過曠場實驗對阿爾茨海默病小鼠模型的自主行為特點進行了分析。

1 材料和方法

1.1 動物及設備

本實驗所用的小鼠是我所構建的 APPswe/ PSΔE9雙轉基因小鼠（SCXK（京）2005-0013）10只、以及野生型C57P6J小鼠每組10只，雌雄各半；設備為：荷蘭Noldus公司Ethovision XT監測分析軟件，Morris水迷宮系統；曠場箱；水池、平臺。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮檢測轉基因小鼠的學習記憶能力變化：選用4、6、8月齡的轉基因 APPswe/PSΔE9雙轉基因陽性小鼠（TG）每組10只及同月齡的野生型C57P6J小鼠（WT）每組10只，雌雄各半。利用Morris水迷宮進行小鼠學習記憶能力分析，我實驗室所用的水迷宮設備為：荷蘭Noldus公司Ethovision XT監測分析軟件，Morris水迷宮系統 。圓形水池直徑為100 cm，平臺在水下0.5 cm，水溫保持在22℃ ～24℃，水中加入牛奶粉，使其不透明，在水池的上方小鼠能看到的地方張貼醒目的幾何圖形，作為小鼠尋找平臺的線索。水迷宮按東南西北分為1、2、3、4區域，平臺即第5區域，位于第4區域內。水迷宮實驗過程分為連續5 d的隱藏平臺獲得實驗和第5天的空間探索實驗兩部分。隱藏平臺獲得實驗時，每天在同一時間訓練小鼠2次，每次使同一只小鼠在不同區域下水，而不同的小鼠在相同的位置下水，每次游泳時間60 s，找到平臺，并在上面停留3 s以上者，視為找到平臺，60 s內沒有找到平臺的要將其引導到平臺上，停留15 s，小鼠沒有找到平臺按60 s計算潛伏期。每次訓練間隔1 h左右。空間探索實驗在滴體的隱藏平臺實驗結束1 h后立即進行，把第五去的平臺去掉，讓小鼠在某一點入水，主要看小鼠在平臺區出現的頻次。隱藏平臺獲得實驗檢測小鼠學習獲得能力，空間探索實驗檢測小鼠空間記憶能力［4-6］。

1.2.2 曠場實驗檢測轉基因小鼠的自主行為：水迷宮實驗結束后3 d，開始進行曠場實驗，所用的計算機失蹤分析系統與水迷宮相同，實驗箱為50×50 cm的曠場，周壁的顏色為白色（一般是與動物的顏色相反），曠場底面被分成面積相等的16塊正方形格子，沿墻格稱外周格，其余為中央格。將小鼠放在正中央格，用固定于曠場上方的攝象機記錄動物一段時間內的行為活動情況，通過計算機示蹤分析系統來分析動物在一定時間內的活動狀態，時間為5 m in。實驗室要保持安靜，室溫為20℃左右，光線充足。觀察指標：方格間穿行次數（動物的四肢從一個格進入另一個格為穿行一次）、直立次數（動物雙前肢同時離地，或者雙前肢放在墻壁上算作直立一次）、中央格停留時間。穿過中央格的次數。研究認為，經過的格子數代表動物的興奮性；站立的次數代表動物對陌生環境的適應能力［7］。

1.3 統計學方法

利用 spss16.0進行統計分析水迷宮實驗小鼠尋找平臺的潛伏期，采用重復測量數據的方差分析［8］，空間探索實驗中在平臺區出現的頻次用單因素方差分析，曠場實驗的各指標用單因素方差分析。數據采用均數 ±標準差表示，P＜0.05.被認為是有統計學差異。

2 結果

2.1 水迷宮結果

經統計學分析，在隱藏平臺獲得實驗中，轉基因模型小鼠學習記憶能力明顯低于野生鼠，尤其在4月齡、6月齡差異具有顯著性（p＜0.05），8月齡差異減小。（圖1）空間探索實驗：模型鼠的記憶能力也低于野生鼠，與隱藏平臺實驗相同，在4月齡、6月齡差異較明顯，8月齡差異減小（圖2）。

圖1 不同年齡動物隱藏平臺實驗潛伏期分析Note：A：Comparison of the escape latency between transgenic and controlmice in age of 3 months.B：Comparison of the escape latency between transgenic and controlmice in age of 6 months.C：Comparison of the escape latency between transgenic and control mice in age of 8 months.Fig.1 Determ ination of escape latency in hidden p latform acquisition training in the mice of different ages

2.2 曠場結果

與野生組小鼠相比，模型組小鼠的活動量明顯增加，模型鼠活動無規律性，經統計其活動總數，直立次數，以及在中央區出現的頻率，4月齡、6月齡時，高于野生型組小鼠40％ ～70％，具有顯著性差異（P＜0.05），8月齡差異減小（圖3），這與水迷宮的結果相同。

3 討論

野生小鼠與轉基因模型小鼠穿越原平臺區次數的比較 *：P＜0.05圖2 空間探索實驗穿越平臺區分析Fig.2 Comparison of the numbers of transgenic and control mice crossing the removed-platform

圖3 APPswe PPSΔE9與野生型小鼠曠場實驗分析Note：A：Comparison of total area entries between the transgenic mice and controlmice.B： Comparison of the numbers of rears of transgenic and control mice.C：Comparison of inner/total area entries of the transgenic and controlmice.Fig.3 Comparison of the APPswe PPSΔE9 transgenic and wild type mice by open field test

根據世界衛生組織公布的數據顯示：全球預計有3 700萬癡呆癥患者，其中絕大部分病例都是由阿爾茨海默病導致的，70歲以上AD的發病危險顯著增加，可以預見在未來的50年里，AD的發病率將增加3倍。AD發病的分子機制包括：遺傳因素、APP分解和Aβ的釋放、游離原子團和能量代謝障礙、鈣調節失衡、脂肪因素、突觸和軸突改變、神經元崩解、神經膠質細胞和小膠質細胞的活化［9］。

APPswe/PSΔE9雙轉基因小鼠是 APP“瑞典家族”突變和PS1第9外顯子缺失突變兩個基因的雙轉基因小鼠［10］。在3月齡開始就出現學習記憶損傷。4.5月齡開始出現老年斑，9～12月齡小鼠大腦出現與阿爾茨海默病患者相似的老年斑，具有和AD相似的病理表型［11］。

臨床上患者最早出現的行為方面的改變主要是記憶力明顯減退、思維分析、判斷能力、視空間辨別功能下降。臨床患者隨著病情的發展，在發病后的2～10年，患者出現空間定向障礙，不能計算，人格上出現易激惹，有患者出現妄想等精神病性癥狀。運動系統表現為煩躁不安。Morris水迷宮廣泛用于嚙齒類動物的視覺相關的空間記憶和工作記憶的測量中，但是否用于測量動物的長時間記憶還存在爭議。利用Morris水迷宮測試AD小鼠模型的學習和記憶能力是進行AD機制研究和藥物評價的重要工具，也是目前主要的行為學測試方法。

但是在第二階段和第三階段AD患者除了學習記憶能力明顯下降，不能計算等學習記憶損傷之外，還出現妄想，煩躁不安，肢體強直，屈曲體位等自主運動等方面的行為特征［3］。而在AD的機制研究和藥物評價的過程中，應該注意到患者出現妄想、煩躁不安、肢體強直、屈曲體位的神經病理生理方面的基礎，但是由于在AD小鼠模型煩躁不安、肢體強直、屈曲體位等行為評價方法研究不多，限制了利用小鼠模型進行AD自主運動機制和藥物評價的研究。曠場實驗（open field test）又稱敞箱實驗，是評價實驗動物在新異環境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。以實驗動物在新奇環境之中某些行為的發生頻率和持續時間等，反應實驗動物在陌生環境中的自主行為與探究行為。我們利用曠場實驗發現AD模型鼠活動明顯增多，并且沒有規律性，頻繁的直立，穿越的總距離增加，一般情況下，小鼠具有趨暗的習性，在曠場實驗中表現為主要在邊緣區活動，而模型鼠無目的的在狂場中奔跑，中央區出現的次數明顯大于正常小鼠，這也說明小鼠易激惹、煩躁不安。可以利用活動總數、直立次數以及在中央區出現的比率等幾項指標反映小鼠的自主活動，并和AD小鼠病情嚴重程度有相關性。在一定程度上可以反映人類患者的煩躁不安，肢體強直等次能夠為特征。曠場實驗能夠檢測動物模型的自主行為變化，可以用做更廣泛的藥物研發實驗。

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