借助慢病毒將EGFP基因導入西藏小型豬胎兒成纖維細胞

張 晟，肖高芳，黃黎珍，那順巴雅爾，賈俊雙，姚志芳，肖 東，顧為望

（南方醫科大學1.比較醫學研究所暨實驗動物中心；2.腫瘤研究所，廣州 510515）

慢病毒屬于逆轉錄病毒的一種，可以高效感染處于分裂期和非分裂期的細胞；借助慢病毒可將其攜帶的外源基因高效整合進宿主細胞基因組中，外源基因可在細胞內長期穩定表達［1］，這些優勢是其它病毒介導的外源基因傳遞系統無可比擬的（http：//vector.bcm.edu/ Lentivirus/Lentivirus_ Vectors.htm）。

由于豬在解剖、生理、生化代謝等方面與人類的十分相似，將豬用作醫學實驗動物近年來呈越來越普遍的趨勢，尤其是各種小型豬品系的建立，促進了這方面的發展與應用。轉基因體細胞克隆豬的問世更增加了以豬作為人類疾病模型的應用；以小型豬為材料，應用轉基因技術制備轉基因豬人類疾病動物模型，具有廣闊應用前景。南方醫科大學實驗動物中心顧為望教授等人［2］于2004年由西藏自治區將藏豬引種至廣州，并進行風土馴化，經5年培育而成了的新的小型豬品種，并將其命名為西藏小型豬（Tibetan m iniature pig）。

本研究的目的在于分離培養西藏小型豬胎兒成纖維細胞（porcine embryonic fibroblasts，PEFs），并進而基于慢病毒介導的轉基因方法將報告基因EGFP導入西藏小型豬的PEFs，以基于PEFs建立慢病毒介導的外源基因體外投遞系統，為下一步利用轉基因體細胞核移植技術制備轉基因西藏小型豬，進而建立相應的人類疾病動物模型打下基礎；同時，該基于PEFs的外源轉基因體外投遞系統的建立也將為借助慢病毒介導的轉基因方式將 Oct4、Sox2、Klf4和 c-Myc四種基因導入西藏小型豬的PEFs，進而將其在體外誘導為iPS細胞，從而建立西藏小型豬的iPS細胞系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 載體：含 EGFP報告基因的慢病毒載體pFUGW由美國Carlos Lois博士惠贈［3］，慢病毒包裝系統psPAX2和pMD2.G由瑞士Didier Trono博士惠贈。

1.1.2 主要試劑：質粒提取試劑盒購自 Qiagen公司。脂質體 LipofectamineTM 2000、高糖 DMEM、Opti-MEM? IMedium、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶和 DMSO等購自Invitrogen公司，培養瓶及培養板等購自 Corning公司。其余試劑為國產或進口化學純或分析純。

1.2 方法

1.2.1 西藏小型豬胎兒成纖維細胞制備：西藏小型豬妊娠35 d，剖腹手術取出子宮，用75％的酒精浸泡消毒，無菌取出胎兒，用含雙抗的 PBS（137 mmol/L NaCl、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、2 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2）漂洗 2遍，放入含雙抗的 PBS中。將獲得的胎兒用含雙抗的 PBS洗滌3次，去除頭、四肢及內臟，剩余部分放入10 mm平皿中，剪成1 mm3的組織碎塊，然后加入膠原酶消化液（膠原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic），轉入50 mL離心管，在37℃水浴搖床內消化。待消化充分后，加入含10％胎牛血清的DMEM培養液，離心后棄上清液，加入含20％胎牛血清的DMEM培養液，轉入10 mm平皿中，于 CO2培養箱內培養（培養條件： 38.5℃、5％CO2和飽和濕度）。當原代細胞生長達80％ ～90％融合時，進行傳代。先吸除舊培養液，用PBS洗滌2遍，棄 PBS并加入胰酶（0.25％trypsin +1 mmol/L EDTA·4Na）進行消化，37°C培養箱中消化約5 min，鏡下觀察細胞消化情況；當大多數細胞變圓，立即加入2 m L消化終止液（DMEM+10％ FBS）終止消化，然后仔細吹打細胞懸液，將細胞懸液收集至15 m L離心管中，700 r/m in離心10 m in。棄上清液后，再用培養液（DMEM+20％FBS）重懸細胞，并輕輕吹打使細胞分散均勻，傳入新的培養皿中繼續培養。

1.2.2 制備攜帶EGFP基因的慢病毒：慢病毒包裝步驟參見文獻［4］和 Didier Trono博士實驗室推薦的操作步驟（http：//tronolab.ep fl.ch和 http：// www.lentiweb.com）。借助 LipofectamineTM2000將慢病毒載體 pFUGW 和包裝質粒 psPAX2及pMD2.G轉染入293FT細胞，轉染48～72 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞發光（綠色熒光）情況，待確認轉染成功后，收集病毒上清，3 000～4 000 r/ min離心15 m in，4℃保存備用。

1.2.3 病毒成功包裝的確認及病毒感染西藏小型豬的PEFs：將攜帶EGFP基因的病毒上清或濃縮的病毒加入內含西藏小型豬的 PEFs的培養板孔內，感染6～12 h后，用相應培養基替換感染液，24～48 h后熒光顯微鏡下觀察是否見綠色熒光。

2 結果

2.1 胎兒成纖維細胞的獲得

圖1 西藏小型豬胎兒成纖維細胞 （PEFs）Fig.1 The Tibetan miniature pig embryonic fibroblasts

原代培養24 h后，可見細胞貼壁生長。經過傳代培養，可獲得較純的胎兒成纖維細胞（PEFs），細胞呈梭形、三角形等，為典型的成纖維形態，胞質近中央處有橢圓形胞核。成群細胞呈現放射狀、漩渦狀等走勢（圖1）。

2.2 慢病毒載體pFUGW鑒定

pFUGW分別經Bam H I和Pst I單酶切，產物經電泳分別可見一條帶和兩條帶，其大小與理論預測值相符（圖2）。

圖2 慢病毒載體pFUGW酶切鑒定Fig.2 Lentiviral vector of pFUGW identified by enzyme digestion

2.3 攜帶EGFP基因慢病毒的包裝與慢病毒感染西藏小型豬的PEFs

慢病毒載體pFUGW與病毒包裝質粒共轉染293FT細胞，48 h后，倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證明轉染成功（圖3）。用經低速離心收集的病毒上清感染PEFs，48 h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，預示病毒已成功生產和慢病毒成功感染PEFs，同時也表明轉基因 EGFP能夠正常表達；此外，對同一視野自然光和熒光下的圖片進行比對，發現慢病毒高效率感染了西藏小型豬的PEFs（圖 4，圖3，4見彩插2）。

3 討論

如前所敘，慢病毒可高效率感染處于分裂期和非分裂期的細胞，這些優勢是其它病毒介導的外源基因投遞系統無可比擬的。為此，本研究針對西藏小型豬胎兒成纖維細胞成功建立了慢病毒介導的體外感染體系，這為接下來借助慢病毒將不同目的基因導入西藏小型豬的 PEFs奠定了基礎；基于攜帶外源轉基因的PEFs提供的細胞核可利用轉基因體細胞核移植技術制備轉基因克隆西藏小型豬，進而基于它建立相應的人類疾病模型動物模型［5］。

此外，目前，通過逆轉錄病毒、慢病毒和腺病毒介導的轉基因方式均可將重編程因子基因（如Oct4、Sox2、K lf4和 c-Myc）導入人和動物的體細胞（如胚胎和成體的成纖維細胞），進而將其在體外重編程為誘導性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）；iPS細胞在克隆形態、生長特性、表面標志物、基因表達模式、表觀遺傳學特征、擬胚體 （Embryoid bodies，EBs）形成、畸胎瘤（teratoma）形成和嵌合體（chimeras）形成（針對動物）等方面與胚胎干細胞（ES細胞）的非常相似；iPS細胞研究不僅具有重要理論意義，而且 iPS細胞在再生醫學、組織工程和藥物發現與評價等方面極具應用價值［6］。而針對西藏小型豬的PEFs建立的慢病毒介導的體外感染體系將為借助慢病毒介導的基因投遞系統將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種轉錄因子基因導入西藏小型豬的PEFs，進而將PEFs在體外誘導為 iPS細胞，從而建立西藏小型豬的 iPS細胞系，該細胞系將為開展干細胞與再生醫學研究和基于西藏小型豬iPS細胞系建立轉基因豬或基因敲除豬奠定良好基礎。

［1］Cockrell AS，Kafri T.Gene delivery by lentivirus vectors［J］.Mol Biotechnol，2007，36（3）：184-204.

［2］ 顧為望，劉運忠，唐小江，等.西藏小型豬血液生理生化指標的初步研究［J］.中國實驗動物學報，2007，15（1）：60 -63.

［3］ Lois C，Hong EJ，Pease S，et al.Germ line transm ission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors［J］.Science，2002，295（5556）：868-872.

［4］ 賈俊雙，孫妍，肖東，等.慢病毒介導的外源基因體外投遞系統的建立［J］.熱帶醫學雜志，2008，8（10）：1028-1029，1037.

［5］Vodicka P，Smetana K Jr，DvoránkováB，et al.The miniature pig as an animal model in biomedical research.［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1049：161-71.

［6］ 申紅芬，姚志芳，賈俊雙，等.誘導性多潛能干細胞 （iPS cells）：現狀及前景展望［J］.生物化學與生物物理進展，2009，36（8）：950-960.