miRNA與胰腺癌的早期診斷

劉明浩 杜奕奇 李兆申

miRNA與胰腺癌的早期診斷

劉明浩 杜奕奇 李兆申

20世紀(jì)60年代，隨著RNA的發(fā)現(xiàn)，人們認(rèn)為RNA在基因的表達(dá)調(diào)控過程中起著至關(guān)重要的作用。近些年，人們發(fā)現(xiàn)了一些長度在18～24個(gè)核苷酸的小分子RNA(miRNA和siRNA)，通過對RNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)參與許多生理過程的調(diào)控，如細(xì)胞生長和凋亡、血細(xì)胞分化、同源異形盒基因調(diào)節(jié)、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生、胚胎發(fā)育和脂肪代謝等，且其在物種的進(jìn)化中相當(dāng)保守，因此miRNA的研究受到了人們的廣泛關(guān)注。

一、miRNA的特點(diǎn)

microRNA(簡稱miRNA)是1993年Lee[1]在線蟲發(fā)育的研究中首次發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小分子RNA，長約18～24個(gè)核苷。miRNA只被內(nèi)源性的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Pri-RNA，然后被加工成熟。其過程包括：RNA轉(zhuǎn)錄酶Ⅱ(Pol Ⅱ)完成miRNA的轉(zhuǎn)錄[2]，形成長鏈的RNA前體，然后被RNA聚合酶ⅢDrosha[3]和Pasha/DGCR8[4]加工成為大約70～100個(gè)核苷酸發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。Pre-miRNA通過依賴RanGTP/Exportin 5轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)[5]，被RNA聚合酶ⅢDICER加工后形成兩條RNA鏈，一條組裝到含有argonaute的沉默復(fù)合體內(nèi)(RISC)，形成成熟miRNA，而另一條鏈降解[6]。

miRNA與靶RNA以堿基對相互作用的方式調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，其作用機(jī)制仍然有爭議，但是抑制翻譯和降解mRNA這兩種方式比較明確，其中對mRNA的降解與RNA干擾途徑比較相似。在動物體內(nèi)，miRNA常以不完全配對的方式作用于靶mRNA，這些作用位點(diǎn)多位于3端的非翻譯區(qū)(3′-UTRs)。如果miRNA和靶mRNA3′-UTRs不完全互補(bǔ)配對，則通過翻譯抑制靶mRNA的表達(dá)，如線蟲中的let-7與靶mRNA3′-UTRs不完全配對結(jié)合后抑制基因的翻譯。當(dāng)miRNA與靶基因完全互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，直接降解mRNA，如果蠅和HeLa細(xì)胞中l(wèi)et-7直接介導(dǎo)RISC分裂切割靶mRNA[7]。最近研究提出，另外一種去腺苷酸化機(jī)制也參與了miRNA的基因調(diào)控，這種調(diào)控與3′腺苷酸尾的清除有關(guān)，且該過程不可逆轉(zhuǎn)[8]。已經(jīng)公布的miRNA數(shù)據(jù)庫記載了695種人類的miRNA[9]，估計(jì)人體內(nèi)miRNA總數(shù)將會在1000到1萬種之間。一種miRNA可以調(diào)控幾種不同基因的表達(dá)，幾種miRNA可以聯(lián)合調(diào)控一種RNA的表達(dá)，這樣形成了一個(gè)龐大的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)人體內(nèi)各種生理活動，因此對miRNA的研究具有重要的意義。

二、miRNA的研究方法

研究miRNA可以通過組織特異性克隆、生物學(xué)信息法和RT-PCR法；進(jìn)行miRNA靶基因篩選的方法有miRU法、Microlnspector法及miRNA-miRNA復(fù)合物分析法。目前日益發(fā)展的微陣列技術(shù)在篩選miRNA基因方面顯示了極大的潛力。最近，Driskell等人[10]建立了表面增強(qiáng)拉曼光譜法(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)用于miRNA檢測和分類。實(shí)時(shí)定量PCR是定量檢測循環(huán)miRNA最常用的有效方法。

三、miRNA與腫瘤

1．miRNA作為抑癌基因：在正常基因調(diào)控過程中，如復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯中任何一個(gè)步驟出現(xiàn)問題，都可能使正常細(xì)胞發(fā)生癌變。最早Calin等[11]證實(shí)了miRNA與腫瘤相關(guān)。miR-15a和miR-16-1在將近65%的慢性淋巴性白血病的病例中表達(dá)完全缺失。而miR-15a和miR-16-1的缺失可導(dǎo)致bcl-2的過表達(dá)，使受損細(xì)胞不能發(fā)生凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的形成。在肺癌、結(jié)腸癌等的研究中發(fā)現(xiàn)，let-7負(fù)調(diào)控原癌基因Ras/let-60的表達(dá)[12-13]，但不影響ras的RNA水平，說明let-7是通過抑制mRNA的翻譯發(fā)揮作用，但不影響其轉(zhuǎn)錄作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，let-7的另一靶癌基因——HMGA2。HMGA2作為一種原癌基因在良性和惡性間充質(zhì)腫瘤等多腫瘤的形成中發(fā)揮作用[14]，而let-7可以負(fù)調(diào)控其表達(dá)。另有研究顯示，miR-21通過直接下調(diào)抑癌基因tropomyosin 1(TPM1)而發(fā)揮作用[15]。

2．miRNA作為癌基因：Burk等[16]發(fā)現(xiàn)，與腫瘤惡性程度及轉(zhuǎn)移有關(guān)的ZEB1可以直接抑制miR-200家族成員miR-141和miR-200c的轉(zhuǎn)錄，這些miRNA又可以負(fù)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β2和ZEB1。ZEB1與這些miRNA形成了一個(gè)負(fù)反饋環(huán)路來調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的分化和腫瘤細(xì)胞的侵襲。miR-17基因簇，包括miR17-5p、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-19b1、miR-20和miR-92，在淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)，說明其發(fā)揮癌基因的作用。Volinia等[17]用芯片分析了6種實(shí)體瘤(肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、前列腺癌、胰管癌)的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-21均顯著過表達(dá)，提示其在腫瘤形成過程中起廣泛的致癌作用。

3．miRNA與人類腫瘤：文獻(xiàn)報(bào)道的其他與癌癥相關(guān)的miRNA有l(wèi)et-7、miR-17-92簇、miR-196a與肺癌，miR-34a與前列腺癌，miR-18、miR-223、miR-224與肝細(xì)胞癌，miR-125b、miR-145、miR-21、miR-155與乳腺癌，miR-143、miR-145與結(jié)直腸癌等。

四、miRNA表達(dá)譜在胰腺癌發(fā)生過程中的作用

1．特異性胰腺癌miRNA：Roldo等[18]的研究結(jié)果顯示，miR-103與miR-107的表達(dá)聯(lián)合miR-155的表達(dá)缺失可以用來區(qū)分胰腺癌和正常組織；一組含有10個(gè)miRNAs亞型的組合可以用來區(qū)分胰腺內(nèi)分泌腫瘤和胰腺腺泡細(xì)胞腫瘤。Bloomston等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-221、miR-222、miR-181a、miR-181b、miR-181d、miR-155在腫瘤樣本中過表達(dá)，其中miR-221最為顯著。Szafranska等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-216和miR-217的表達(dá)聯(lián)合miR-133a的表達(dá)缺失可以用來鑒定胰腺組織。應(yīng)用定量RT-PCR技術(shù)檢測，只有miR-217和miR-196a在正常胰腺、慢性胰腺炎和腫瘤組織間差別顯著。Lee等[21]采用實(shí)時(shí)PCR定量分析胰腺癌標(biāo)本、胰腺良性腫瘤、慢性胰腺炎、正常胰腺組織和9種胰腺癌細(xì)胞株的200種前體miRNA表達(dá)和分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)譜有明顯的不同，其中包括miR-155、miR-21、miR-221、miR-222等；原位PCR進(jìn)一步顯示前三位表達(dá)的miR-221、miR-376a、miR-301定位于腫瘤細(xì)胞，而不在基質(zhì)或正常腺管。Zhang等[22]研究了96種miRNA亞型在胰腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種miRNAs(miR-196a、miR-190、miR-186、miR-221、miR-222、miR-200b、miR-15b、andmiR-95)有顯著地過表達(dá)。

2．非特異性胰腺癌miRNA：Dillhoff等[23]比較胰腺癌及癌旁組織、慢性胰腺炎、正常胰腺組織中miR-21的表達(dá)水平，證實(shí)miR-21在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，癌旁組織沒有miR-21的過表達(dá)，但miR-21在肺癌、胃癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌甚至胰腺的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤都有過表達(dá)。miR-375在小鼠的胰島細(xì)胞中特異性地表達(dá)，其在腫瘤組織比正常組織表達(dá)水平稍高，但不能區(qū)分胰島素瘤和胰腺的非功能性腫瘤[18]。

3．其他與胰腺癌相關(guān)的miRNA：miR-21和miR-196a-2與胰腺癌的預(yù)后有關(guān)。如沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，弱表達(dá)miR-21患者平均生存期與強(qiáng)表達(dá)miRNA患者平均生存期有差異(27.7個(gè)月對15.2個(gè)月,P=0.037)[23]。高表達(dá)miR-196a-2與低表達(dá)miR-196a-2患者的生存期也有顯著差異(平均生存期14.3個(gè)月、95%CI12.4～16.2對平均生存期26.5個(gè)月、95%CI23.4～29.6,P=0.009)[19]。

在胰腺癌基因方面，miR-155通過負(fù)調(diào)控TP53INP1而發(fā)揮癌基因的作用[24]，p53基因可以抑制miR-221的表達(dá)。此外，某些miRNA與胰腺癌的功能及轉(zhuǎn)移有關(guān)，如miR-204的過表達(dá)與胰島素的分泌有關(guān)； miR-21的過表達(dá)與高ki67的增殖指數(shù)和出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。

至今研究證實(shí)的胰腺癌、胰腺良性腫瘤、慢性胰腺炎、正常胰腺組織間miRNA表達(dá)譜的差異只是具體的miRNA亞型不同，某種miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)也有些出入。這些結(jié)果說明了miRNA表達(dá)的改變與胰腺的內(nèi)分泌功能、胰腺腫瘤的發(fā)生及惡變有一定聯(lián)系，但如果想作為胰腺癌腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于臨床，還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

五、血清miRNA與胰腺癌的早期診斷

血清miRNA具有良好的抗RNase降解能力，在煮沸、高或低pH值、長時(shí)間儲存、凍融循環(huán)等條件下保持穩(wěn)定，以完整的形式存在。因此，采用常規(guī)RNA提取方法就可以獲得滿足實(shí)驗(yàn)要求的miRNA。應(yīng)用半定量RT-PCR的方法可以在正常人的血清和血漿中檢測到let-7a、miR-192、miR-21、miR-25、miR-451和miR-221，并且男性和女性血清miRNA譜沒有差異，兩份無關(guān)的樣本的miRNA是接近的[25]。正常人血清和血細(xì)胞miRNA譜無差異，但肺癌患者的血清和血細(xì)胞miRNA譜有顯著差異(血清和血細(xì)胞中共存57種，73種只存在于血清中)[26]。提示可通過比較患者血清和血細(xì)胞miRNA的譜的差異來提高診斷腫瘤的特異性和敏感性。miRNA分子同已知的循環(huán)核酸(DNA和RNA)一樣,廣泛存在于正常人和不同患者的血清和血漿中,并且隨著生理狀況、疾病的種類和病程的不同,miRNA分子在血清中存在的種類和數(shù)量將發(fā)生變化。

以往研究證實(shí)，腫瘤會使血清中miRNA譜發(fā)生變化。最初Lawrie等[27]發(fā)現(xiàn)，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中有較高水平的miR-21，且與腫瘤復(fù)發(fā)及患者生存期有關(guān)。miR-141做為前列腺癌的標(biāo)志物有高度的敏感性和良好的特異性。Mitchell等[28]將人前列腺癌細(xì)胞株移植到小鼠制作出異種移植模型，小鼠血清中miR-141也顯著地過表達(dá)。Chen等[26]報(bào)道，肺癌、結(jié)直腸癌及糖尿病患者血清中均有特殊的miRNA表達(dá)譜。如在正常血清中檢測不到的63種miRNAs在肺癌患者血清中可以檢測到；在腫瘤形成中起重要作用的miR-25和miR-223在肺癌患者的血清中呈高表達(dá)；結(jié)直腸癌與肺癌患者血清中一些腫瘤相關(guān)miRNA譜是相同的，提示腫瘤患者血清中存在一些共同的腫瘤相關(guān)miRNA譜。腫瘤導(dǎo)致的血清miRNAs水平的變化，還不清楚是腫瘤細(xì)胞壞死或脫落進(jìn)入周圍循環(huán)后釋放miRNAs，還是腫瘤細(xì)胞直接釋放miRNAs進(jìn)入周圍循環(huán)。因此，還需更加努力深入地研究。

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2009-05-26)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.027

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

劉明浩，Email:8684@163.com