沉默畸胎瘤衍生生長因子-1基因對胰腺癌細胞株PANC1侵襲力的影響

范鈺 吳鶯 徐軍 鐘錫明

·論著·

沉默畸胎瘤衍生生長因子-1基因對胰腺癌細胞株PANC1侵襲力的影響

范鈺 吳鶯 徐軍 鐘錫明

目的探討TDGF-1基因沉默對胰腺癌細胞株PANC1侵襲力的影響。方法設計并合成3個(S1、S2、S3)靶向TDGF-1 基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，篩選出沉默效果最好的siRNA。以該siRNA的不同濃度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)轉染PANC1細胞，并設對照組和脂質體組。采用實時定量PCR和Western blotting檢測TDGF-1 mRNA和蛋白表達，以軟瓊脂集落培養試驗和Boyden小室檢測癌細胞的錨著不依賴性增殖和侵襲能力，并將轉染48 h的細胞接種裸鼠，觀察癌細胞的體內侵襲。結果siRNA轉染組細胞的TDGF-1 mRNA和蛋白表達水平呈濃度和時間依賴性下降，且較脂質體組明顯降低(P值均<0.01)。對照組細胞集落形成數和穿膜細胞數分別為19.8±2.2和49.8±2.6；siRNA組呈濃度依賴性明顯減少，12.5 nmol/L轉染組分別為5.6±1.2和8.1±1.1。對照組、脂質體組和12.5 nmol/L轉染組接種4周后裸鼠種植瘤體積分別為(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3。對照組和脂質體組種植瘤侵犯周圍肌層組織，轉染細胞組未見侵犯。結論采用RNA干擾技術沉默PANC1細胞的TDGF-1基因表達可抑制癌細胞的侵襲力。

胰腺腫瘤； 畸胎瘤衍生生長因子-1； 腫瘤侵襲； 小分子干擾RNA

畸胎瘤衍生生長因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)是一種自分泌型腫瘤生長因子，是表皮生長因子家族重要成員之一[1]。它定位在人類染色體3p21.3[1]，編碼cripto蛋白。研究發現，TDGF-1基因在乳腺癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌、膀胱癌及前列腺癌等腫瘤中均過度表達，并與腫瘤浸潤有關，而在正常組織中不表達或低表達[2]。為此，本實驗應用RNA干擾技術沉默胰腺癌PANC1細胞TDGF-1 基因的表達，觀察其對癌細胞侵襲力的影響。

材料和方法

一、細胞培養及轉染

胰腺癌細胞株PANC1(ATCC公司)常規培養傳代。轉染前1 d，將1×105對數期生長細胞接種于24孔培養板，每孔1 ml，次日應用Oligofectamine進行轉染。細胞分對照組、脂質體組、siRNA-C組和siRNA組。設計3個siRNA，S1：正義鏈5′-UUCGGCCUCGGUCUUCCCATT-3′，反義鏈5′-UGGGAAGACCGAGGCCGAATT-3′，靶點175～195；S2：正義鏈5′-GGCUGCUGCUACAAUGUCCTT-3′，反義鏈5′-GGACAUUGUAGCAGCAGCCTT-3′，靶點630～650；S3：正義鏈5′-GAAUGAAGCCUCCUUAGAATT-3′，反義鏈5′-UUCUAAGGAGGCUUCAUUCTT-3′，靶點1544～1564。陰性對照siRNA-C：正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTDTD-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATDTDT-3′。所有siRNA均由美國Dharmacon公司合成。對照組未經任何處理；脂質體組用脂質體處理；siRNA-C組轉染siRNA-C； siRNA組分別轉染3個siRNA。選其中干擾效果最佳的siRNA，再用不同濃度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)轉染細胞。每組設3個復孔。轉染后分別培養24、48、72 h，收集細胞。

二、細胞TDGF-1 mRNA檢測

采用熒光實時定量PCR檢測。TDGF-1上游引物5′-CAATTCGGCCTCGGTCTTC-3′，下游引物5′-TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT-3′；FAM探針：5′-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3′-TAMRA。以GAPDH為內參。PCR反應條件：95℃ 3 min，95℃ 30 s 、52℃ 45 s、72℃ 45 s，35 個循環，72℃再延伸7 min。結果計算參照文獻[7]， cDNATDGF-1=cDNAGAPDH×2△CT(△CT=CTGAPDH-CTTDGF-1)。

三、細胞TDGF-1蛋白檢測

采用Western blotting法。以目的條帶與β-actin灰度值的百分值表示蛋白表達量。

四、軟瓊脂集落形成試驗

參照文獻[3]的方法計數集落形成數。

五、體外侵襲試驗

參照文獻[4]方法，采用Boyden小室模型。400高倍鏡下計算5個視野內穿膜細胞數，取均值。

六、裸鼠體內侵襲試驗

Balb/c裸鼠，15只，雌性，4周齡，體重14～18 g，購自中國科學院上海生物化學研究所，SPF級。分為對照組、脂質體組和siRNA組，各5只。對照組接種未轉染的胰腺癌細胞；脂質體組接種脂質體處理的癌細胞；siRNA組接種12.5 nmol/L siRNA轉染48 h后的癌細胞。裸鼠皮下接種細胞數為5×105個。4周后斷頸處死裸鼠，觀察腫瘤在體內的浸潤和轉移，并常規行病理檢查。

七、統計學方法

結 果

一、靶向TDGF-1 siRNA的篩選

以對照組細胞TDGF-1 mRNA 表達量為1，S1、S2、S3 siRNA轉染細胞的TDGF-1 mRNA表達量分別為(9.2±0.3)%、(50.0±0.5)%和(11.5±0.8)%，S1的siRNA抑制效果最好，故以下實驗均應用S1的siRNA轉染的細胞。

二、轉染細胞TDGF-1mRNA和蛋白表達的變化

與脂質體組比較，siRNA組TDGF-1 mRNA和蛋白表達水平均呈濃度和時間依賴性明顯下降(P值均<0.01，表1)。

三、細胞集落形成數的變化

對照組、脂質體組、siRNA-C組及siRNA 3.125、6.25、12.5 nmol/L組PANC1細胞在軟瓊脂培養基上的集落形成數分別為19.8±2.2、19.6±2.2、19.5±1.9、12.5±1.9、9.9±1.8、5.6±1.2，siRNA轉染的細胞集落生長數呈濃度依賴性減少(P<0.05)。

表1 轉染細胞TDGF-1 基因mRNA和蛋白表達的變化

注：與脂質體組比較，aP<0.01

四、細胞侵襲力的變化

對照組、脂質體組、siRNA-C組及siRNA 3.125、6.25、12.5 nmol/L組穿過濾膜的細胞數分別為49.8±2.6、49.6±2.5、49.5±1.8、31.8±1.9、16.9±2.1、8.1±1.1，siRNA組細胞的侵襲力呈濃度依賴性下降(P<0.05)。

五、裸鼠移植瘤

對照組、脂質體組和siRNA(12.5 nmol/L)轉染組裸鼠均在接種后第4天左右開始形成腫瘤，接種后4周瘤體積分別為(2.228±0.026)cm3、(2.186±0.028)cm3和(0.728±0.023)cm3。3組裸鼠均未見轉移灶，但對照組和脂質體組種植瘤細胞侵犯周圍肌層組織(圖1a)及血管(圖1b)，而siRNA轉染組未見侵犯。

圖1 癌細胞侵襲橫紋肌(a)及血管(b)(HE ×200)

RNA干擾(RNAi)能夠使基因的mRNA轉錄被相應的雙鏈RNA分子敲除，關閉基因表達的效果遠強于應用正義和反義RNA[5]。siRNA是指RNAi干擾過程中細胞內產生的長約21～25核苷酸的小雙鏈RNA，是產生RNAi的中間效應分子。目前人工可合成siRNA，具有明顯的抑制相應基因mRNA轉錄的效果[6]。

本實驗采用化學方法合成靶向TDGF-1基因的siRNA，轉染胰腺癌PANC1細胞后，細胞TDGF-1 mRNA和蛋白表達水平呈濃度和時間依賴性明顯下降。說明該siRNA能有效沉默基因的表達。

腫瘤細胞在軟瓊脂上培養后形成集落的多少與細胞惡性程度呈正相關。癌細胞侵襲能力強，則在軟瓊脂上形成的集落數目多。本實驗結果顯示，siRNA轉染細胞形成的集落數呈濃度依賴性減少，提示細胞的侵襲能力被明顯抑制。

Boyden小室模型也是廣泛應用于檢測癌細胞侵襲試驗的經典模型。本實驗結果顯示，siRNA轉染組穿膜細胞數呈濃度依賴性明顯減少，且裸鼠種植瘤的癌細胞未侵犯種植瘤周圍組織，提示抑制TDGF-1基因表達可抑制胰腺癌細胞的體外、體內的侵襲能力。

[1] Ciccodicola A,Dono R,Obici S,et al.Molecular characterization of a gene of the ‘EGF family’ expressed in undifferentiated human NTERA2 teratocarcinoma cells.EMBO J,1989,8:1987-1991.

[2] Salomon DS,Bianco C,De Santis M.Cripto:a novel epidermal growth factor (EGF)-related peptide in mammary gland development and neoplasia. Bioessays,1999,21:61-70.

[3] 范鈺，鄭樹，趙剛.青蒿琥酯對乳腺癌MCF-7細胞抗失巢凋亡的影響.中國病理生理雜志，2006，22:571-575.

[4] Fan Y,Zhang YL,Wu Y,et al.Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses invasion through inducing anoikis in human colon cancer cells.World J Gastroenterol,2008,14:428-434.

[5] Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature,1998,391:806-811.

[6] Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.Nature,2001,411:494-498.

2009-05-04)

(本文編輯：屠振興)

Effectsofteratocarcinoma-derivedgrowthfactor-1oninvasionofhumanpancreaticcancercelllinePANC1

FANYu,WUYing,XUJun,ZHONGXi-ming.

CancerInstitute,AffiliatedPeople′sHospital,JiangsuUniversity,Zhenjiang212002,China

Correspondingauthor:FANYu,Email:yuf36@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of the silence of teratocarcinoma-derived growth factor-1(TDGF-1) gene on invasion of human pancreatic cancer cell.MethodsThree small interfering RNA (siRNA ) targeting for TDGF-1 genes (S1, S2, S3) were designed and established, then the gene with the best silencing effects was screened. Human pancreatic cancer cell line PANC1 were transfected by siRNA with different concentrations (3.125, 6.25, 12.5 nmol/L), the cells without transfection, and simply treated with liposomes were controls.The expressions of mRNA and protein of TDGF-1 were determined by real time PCR and Western blot assay, respectively. The anchorage-independent growth was examined by clon formation in soft agar, and invasion ability was evaluated by boyden chamber model. PANC1 cells with transfection for 48h were injected into the nude mice to evaluate the invasion abilityinvivo.ResultsThe expressions of TDGF-1 mRNA and protein of cells transfected by siRNA were decreased in a dose- and time-dependent manner, which were significantly lower than those in liposomes group. Number of colony formation and transmembrane cell were 19.8±2.2 and 49.8±2.6 in the control group, and 5.6±1.2 and 8.1±1.1 in the 12.5 nmol/L transfection group. The volumes of tumor 4 weeks after transplation in the control group, liposomes group and the 12.5 nmol/L transfection group were (2.228±0.016) cm3, (2.186±0.028) cm3and (0.728±0.023) cm3.ConclusionsTDGF-1 gene silence could inhibit invasion ability of human pancreatic cancer cell PANC1.

Pancreatic neoplasms； Teratocarcinoma-derived growth factor-1； Neoplasm invasiveness； Small interfering RNA

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.017

中國博士后科學基金(2003033547)

212002 鎮江，江蘇大學附屬人民醫院腫瘤研究所

范鈺，Email:yuf36@sina.com