蛋白酶體抑制劑 MG132對動脈粥樣硬化的影響

肖 玲, 祝鴻雁, 王連堃, 郝愛萍

自從泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin proteasome system,UPS)[1]被發現以來,其在科研領域里的成就取得了突飛猛進的進展,受到了極大的關注和重視,有研究顯示 UPS可能在動脈粥樣硬化形成中發揮一定的作用,但其具體機制尚不明確。本試驗選用家兔高脂飲食加頸總動脈內皮球囊損傷術構建血管內皮損傷后動脈粥樣硬化的動物模型,觀察局部應用蛋白酶體抑制劑 MG132對家兔球囊拉傷后動脈粥樣硬化的影響,初步探討 UPS在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 實驗動物為體重 2～2.5kg左右的新西蘭純種大白兔,由哈爾濱醫科大學動物部提供。術后高脂飼料(含 1%膽固醇、3%豬油和15%蛋黃)喂養。

1.2 實驗分組 新西蘭大白兔 30只,隨機分成 3組。①高脂組(n=10);②MG132(1)組(n=10);③MG132(2)組(n=10),球囊拉傷頸總動脈,采用局部注射的方法在頸總動脈注入 1mmol/L MG132(蛋白酶體抑制劑)150μl,持續 5m in,PBS沖洗 2次。各組兔均以普通飲食 1周后加以高脂飼料(1%膽固醇、3%豬油和 15%蛋黃)喂養 8w。MG132(1)組術后血管局部即應用 MG132;MG132(2)組術后 4w局部應用 MG132。

1.3 頸總動脈球囊損傷模型的制備 普通飲食 1w后 ,行家兔頸總動脈球囊內皮剝脫術,逆行插入 4FPTCA球囊導管(導管直徑 1.2mm,球囊膨脹直徑 2.0mm,球囊長度 20mm)至頸總動脈段 40mm處,球囊內充以 0.5～0.7ml肝素生理鹽水至 3個大氣壓,牽拉旋轉導管,回抽球囊內液體,使壓力降為零后重新注入導管,并牽拉旋轉導管,重復上述過程共 3次,拔出球囊導管。于手術顯微鏡下縫合動脈切口,取下無創血管夾,可見頸總動脈有良好充盈。逐層縫合皮下組織及皮膚。術后切口局部給予硫酸慶大霉素 16萬單位抗炎處理。

2 結 果

2.1 肉眼大體觀察 高脂組兔的頸總動脈內膜增厚和管腔狹窄最明顯,內膜面見淺黃色斑塊樣突起,大小不等,散在或融合成片,部分管腔幾乎完全閉塞。MG132(1)組兔右頸總動脈血管組織結構基本正常;MG132(2)組兔的右頸總動脈管腔比較光滑,部分兔血管內膜有奶油樣變化,頸總動脈內膜略有增厚,管腔也略有狹窄。

2.2 光鏡下 HE染色觀察 高脂組：兔右頸動脈內皮細胞脫落,可見粥樣斑塊,可見斑塊“肩部”破裂,“纖維帽”斷裂、斑塊崩解,血栓與大的斑塊相鄰,斑塊破裂及血栓處可見大量炎性細胞浸潤。MG132(1)：組兔右頸動脈血管組織結構基本正常,管腔呈圓形,內膜、中膜和外膜分界清楚,管腔面由單層內皮細胞覆蓋,內彈力膜完整,中膜層較厚,有8～12層環行排列的血管平滑肌細胞。MG132(2)：組偶可見少量脂質沉積。內膜向心性增厚、管腔狹窄,表面有纖維組織覆蓋,形成典型的纖維帽。

3 討 論

UPS是生物體內進行蛋白質選擇性降解[2]的重要途徑之一。研究表明 UPS通過調節細胞凋亡[3～5]進而調節動脈粥樣硬化的發生發展。凋亡的細胞主要由巨噬細胞和平滑肌細胞組成。幾乎所有的動脈粥樣硬化均有細胞凋亡現象,這可能與內膜增生有關。一些短壽命的促凋亡蛋白 p53、Bax、p27在細胞內是通過 UPS降解的。對于處于活躍增殖期的細胞(如血管平滑肌細胞)UPS主要通過 NF-κB抑制細胞凋亡,從而抑制血管平滑肌細胞發生增殖性病變。Herrmann J[6]等研究中發現用高膽固醇飼料喂養的豬的動脈壁內的泛素聚合物和氧化應激的產物均明顯高于正常組織,表明 UPS參與了動脈粥樣硬化的形成。VersariD[7]等對頸動脈粥樣硬化斑塊的研究中發現,有癥狀患者的頸動脈粥樣硬化斑塊和增生的平滑肌細胞內泛素聚合物和氧化應激的表達均較無癥狀的患者高,表明 UPS在人的動脈粥樣硬化行程中發揮重要作用。MG132是一種有效、可逆的醛基肽類性蛋白酶體抑制劑[8],能阻止 26S蛋白酶體對泛素結合蛋白的降解、抑制 20S蛋白酶體的糜凝乳蛋白酶活性,從而阻斷泛素蛋白媒體通路。家兔高脂飲食結合動脈內皮剝脫術[9]能在短時間內造成血管動脈粥樣硬化病變,它克服了單純用高脂飲食復制模型所帶來的時間長、效果不穩定、病變與人類動脈粥樣硬化病變差異大和不易形成特定部位病變等特點。本實驗復制的球囊損傷后血管動脈粥樣硬化動物模型,其頸總動脈病變處管腔不規則,內膜向心性肥厚,管腔明顯狹窄,甚至完全閉塞,平滑肌細胞自內膜下遷移并大量增殖。我們在球囊拉傷家兔頸總動脈內膜的基礎上,同時局部應用蛋白酶體抑制劑 MG132后,較球囊損傷組明顯減輕,這說明 MG132具有抗家兔頸總動脈球囊損傷后血管動脈粥樣硬化的作用。在本實驗 MG132(1)組我們發現大部分血管壁為正常結構,鏡下無動脈粥樣硬化表現,早期應用 MG132,由于抑制了細胞凋亡從而抑制了平滑肌細胞增殖,進而抑制了動脈粥樣硬化的發生。

對于已經分化并且處于非分裂期的細胞如在不穩定的動脈粥樣硬化斑塊中的細胞 UPS還可聚集Ox-LDL或 LDL,誘導人單核細胞泛素耦聯酶 E2-25k表達并泛素化細胞內蛋白,參與泡沫細胞形成動脈粥樣硬化復合病變階段,UPS參與輔助 T細胞活化?；罨?T細胞釋放 INF-r,減低動脈粥樣硬化中細胞外基質蛋白合成,促使不穩定斑塊破裂。在本實驗MG132(2)組我們發現穩定性斑塊居多,是由于我們在動脈粥樣硬化發生以后應用 MG132,所以鏡下可見大量動脈粥樣硬化斑塊,但仍以穩定性斑塊為主,主要是由于高脂飼料加改良球囊內膜損傷造成動脈粥樣硬化,而后應用 MG132抑制 UPS的活性,從而抑制斑塊破裂。目前對泛素-蛋白酶體通路與動脈粥樣硬化發生的關系尚處于探索階段,蛋白酶體抑制劑的發現為研究 UPS在球囊損傷血管內膜后血管動脈粥樣硬化的作用提供了直接有力的手段。可以推測 UPS在球囊損傷后血管狹窄和血管壁細胞凋亡過程中有重要作用,其中的機制有待進一步闡明。

綜上所述,泛素蛋白酶體系統在動脈粥樣化形成的不同階段發揮不同的作用,隨著其在醫學科研領域里的廣泛應用,人們已經逐漸提高了對它的認識。近 20年來該領域的研究已經取得很多令人鼓舞的成果和進展,部分成果已開始應用到臨床疾病與腫瘤的預防和治療上。但另一方面,仍有大量的問題和機制尚未清楚,有待進一步深入研究。

[1]Glickman MH,Ciechanover A.The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway：destruction for the sake of construction[J].Physiol Rev,2002,82(2)：373-428.

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[3]Chang YC,Lee YS,Tejima T,etal.mdm2 and bax,downstream mediators of the p53 response,are degraded by the ubiquitin-proteasome pathway[J].Cell Growth Differ,1998,9(1)：79-84.

[4]Monney L,Otter I,Oliver R,etal.Defects in theubiquitin pathway induce caspase-independent apoptosis blocked by Bc l-2[J].J Biol Chem,1998,273(11)：6121-6131.

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[6]Herrmann J,Gulati R,Napoli C,etal.Oxidative stress-related increase in ubiquitination in early coronary atherogenesis[J].FASEB J,2003,17(12)：1730-1732.

[7]Versari D,Herrmann J,Gossl M,etal.Qysregulation of the ubiquitinproteasome system in human carotid atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26：2132-2139.

[8]劉俊文,楊向東,王 仁,等.蛋白酶體抑制劑 MG132誘導人巨噬細胞 THP21凋亡[J].中國動脈硬化雜志,2004,12(3)：271-274.

[9]管耘園,葉炳華,盧輝和,等.球囊損傷加高脂喂養建立兔頸動脈粥樣硬化模型[J].實驗動物科學,2007,24(1)：6-9.