花粉管通道法在玉米轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用

李向龍，張力全，張曉東

（北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100089）

玉米是世界主要糧食飼料和工業(yè)原料之一，隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步，世界各國(guó)對(duì)玉米的需求量逐年增加。預(yù)計(jì)到2020年，發(fā)展中國(guó)家對(duì)玉米的需求量估計(jì)會(huì)比1995年增加50%，到2030年,我國(guó)的玉米需求量將會(huì)達(dá)到1.60億 ～1.75億t[1]。但是，目前的玉米生產(chǎn)和玉米育種中面臨著推廣品種單一化、育種材料遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄、基因庫(kù)日益貧乏的問題，加之常規(guī)育種周期長(zhǎng)，預(yù)見性差，故20世紀(jì)70年代以來，研究者開始利用基因轉(zhuǎn)化方法 （如EFG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電激轉(zhuǎn)化法、子房注射法以及花粉管通道法等）定向改造玉米的某些性狀，加快了玉米的育種進(jìn)程[2]。本文就目前玉米自交系轉(zhuǎn)基因育種中花粉管通道法應(yīng)用的研究成果作一綜述。

1 花粉管通道法的提出

花粉管通道法是我國(guó)科學(xué)家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”報(bào)道的研究成果。其原理是將外源DNA片段在作物受粉后特定時(shí)期注入柱頭或花柱，外源DNA沿著花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化不具備正常細(xì)胞壁的受精卵、合子及早期胚胎細(xì)胞[3]。花粉管通道法自問世以來，引起國(guó)際上的廣泛關(guān)注，美、歐、亞等一些實(shí)驗(yàn)室將這一技術(shù)應(yīng)用于稻、麥、棉、豌豆、牧草等基因重組和總DNA導(dǎo)入的研究中，其中在水稻、小麥等糧食作物上的應(yīng)用比較多，在一定程度上拓寬了其種質(zhì)基礎(chǔ)，但在改良玉米育種中應(yīng)用較少。

2 花粉管通道法在玉米改良上的應(yīng)用

2.1 研究?jī)?nèi)容

目前，花粉管通道法用于改良玉米自交系的研究主要集中在抗蟲、抗除草劑以及提高植株抗逆性上，其中抗除草劑和抗Bt蟲蛋白基因的研究成果顯著，孟山都和先正達(dá)兩個(gè)國(guó)際知名公司已將其推廣應(yīng)用于生產(chǎn)中。

2.2 研究成果

在玉米自交系改良中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用花粉管通技術(shù)獲得的品種有30多個(gè)。1986年Ohta在美國(guó)科學(xué)道技術(shù)取得了大量有價(jià)值的成果，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年利用此院報(bào)上報(bào)道應(yīng)用外源 DNA與玉米花粉混合授粉，得到F0轉(zhuǎn)化率高達(dá)10%的胚乳基因轉(zhuǎn)移[4]。王秀君等采用花粉管通道法將含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表達(dá)載體pUmG2導(dǎo)入優(yōu)良玉米自交系X90中，經(jīng)檢測(cè)有陽(yáng)性植株為29株[5]。張慧英等提取甘蔗DNA，采用該方法將其導(dǎo)入普通玉米自交系普7313，從自交后代中選出2個(gè)葉綠素、可溶性糖、蛋白質(zhì)含量均比對(duì)照提高的優(yōu)良株系；他們還將提取的糯質(zhì)玉米12-9-10 DNA導(dǎo)入甜玉米自交系孟加拉超甜玉米，其后代產(chǎn)生了株高、穗位高、葉面積等性狀上的變異[6,7]。王罡等采用該技術(shù)，以生產(chǎn)上7922等9個(gè)優(yōu)良玉米自交系為材料，將Bt殺蟲蛋白基因?qū)肫渲校罱K得到3株抗性轉(zhuǎn)化植株[8]。關(guān)淑艷等利用該技術(shù)將淀粉分支酶基因的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米自交系鐵7922、吉853、丹 340、Mo17、5003 和春 09 中，初步證明外源目的基因已整合到玉米基因組中，并得到了轉(zhuǎn)化植株的種子[9]。劉丹梅以抗蟲的胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)為供體，以8個(gè)品種玉米為受體進(jìn)行外源DNA直接導(dǎo)入，通過對(duì)抗性植株的初步分子鑒定，證實(shí)外源CpTI基因存在并整合入獲得的玉米基因組植主中[10]。此外，研究者還在玉米自交系抗逆性上取得一定成果，例如丁群星等研究發(fā)現(xiàn)玉米矮花葉病毒 (MDMV)B株外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)出對(duì)MDMV的抗性；張永勝等人還研究了將抗旱耐鹽基因以及抗葉斑病基因?qū)胗衩鬃越幌抵校@得了初步成功[11,12]。

2.3 花粉管通道法轉(zhuǎn)化方式

花粉管通道法將外源DNA導(dǎo)入玉米自交系中的轉(zhuǎn)化方式有柱頭滴加法、花粉粒攜帶法、子房微注射法、開苞導(dǎo)入法等。但筆者結(jié)合自身經(jīng)歷，認(rèn)為柱頭滴加法不論從轉(zhuǎn)化效率還是對(duì)幼穗的傷害程度上都有一定的優(yōu)勢(shì)。該方法的主要技術(shù)手段是選取自交授粉后18～26 h的玉米果穗，剪去距穗頂部l cm以上的苞葉和花絲，將DNA滴在切口處，外源DNA經(jīng)花粉進(jìn)入時(shí)形成的通道進(jìn)入幼胚，從而完成外源DNA導(dǎo)入過程。1995年祁永紅等報(bào)道了利用豬頭滴加法成功將外源總DNA導(dǎo)入玉米自交系，此后又有研究者陸續(xù)報(bào)道了利用該法獲得了具有廣泛變異的不同類型的玉米自交系[13 ～15]。

3 花粉管通道法應(yīng)用前景展望

花粉管通道法優(yōu)勢(shì)眾所周知，其在玉米自交系轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用越來越普遍，但其轉(zhuǎn)化效率低仍然是制約其應(yīng)用的瓶頸，如何進(jìn)一步提高其導(dǎo)入率將是今后很長(zhǎng)一段時(shí)間研究的重點(diǎn)；此外，對(duì)玉米受粉后花粉管通道形成的生理機(jī)制、導(dǎo)入外源DNA的最佳時(shí)間以及轉(zhuǎn)基因后代可能產(chǎn)生的變異等還不能很好的解決，這在一定程度上將限制其發(fā)展。今后，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步完善分子育種技術(shù)的理論和應(yīng)用研究，以充分發(fā)揮其簡(jiǎn)便快速的優(yōu)勢(shì)，提高育種水平，培育出更多更好的優(yōu)良新品種。

[1]戴羅杰,郭春雨,李飛宇.微胚乳超高油玉米的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(19）:8925 ～ 8927， 8934.

[2]高武軍，盧龍斗，魏開發(fā).根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米遺傳轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學(xué)，2004，l20 （6）:26～ 28.

[3]Zhou G.Y，Weng J，Zeng Y.S，etc.Introduction ofexogenous DNA into cottonembryos[J].Methods in Enzymolog， 1983，（101）:433 ～ 481.

[4]Ohta Y.High—efficiency genetic transformation of maize by a mixture of pollen and exogenous DNA[J].Proc Natl Acad Sci USA，1986，（83）:715 ～ 719.

[5]王秀君，郎志宏，陸偉，等.利用花粉管通道法將耐草甘膦基因mG2-epsps導(dǎo)入玉米自交系的研究初報(bào)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2008，10(4）:56 ～ 62.

[6]張慧英，劉愛花，薛艷霞.甘蔗DNA導(dǎo)人玉米自交系性狀變異的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2008，47（5）:498 ～ 500.

[7]張慧英，馮銳，呂平，等.外源DNA直接導(dǎo)入甜玉米自交系后代性狀變異[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22 （9）:186～ 188.

[8]王罡，杜娟，張艷華.用花粉管通道法將Bt殺蟲基因?qū)擞衩鬃越幌档难芯縖J].玉米科學(xué)，2002，10 （1）:36 ～ 37.

[9]關(guān)淑艷，張健華，柴曉杰，等.花粉管通道法將淀粉分支酶基因反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米自交系的研究[J].玉米科學(xué)，2005，3 （4）：13 ～ 15，23.

[10]劉丹梅.外源DNA通過花粉管通道法導(dǎo)人玉米的研究[J].丹東紡專報(bào)，2004，11 （4）:5 ～ 6，8.

[11]丁群星，謝友菊，戴景瑞，等.用子房注射法將Bt毒蛋白基因?qū)胗衩椎难芯縖J].中國(guó)科學(xué)（B 輯），1993，（7）:669 ～672.

[12]Zhang Yongsheng，Zhai Shumei，Yang Aifang，et.a1.Maize transformation via pollen tube pathway and the inheritance of transgene in progeny[J].HIGH TECHNOLDGY LETTERS，2005.1 （2）： 202 ～ 206.

[13]祁永紅，錢華，等.外源DNA導(dǎo)入玉米自交系獲得變異新品系[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998 （5）：1～ 4.

[14]常利芳,王立新,王省芬,等.花粉管通道轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué),2003，7 （1）:45 ～ 50.

[15]于晶,任朝陽(yáng),閔麗,等.花粉管通道法在單子葉作物遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37 （1）:130 ～134.