腫瘤血管擬態形成機制研究進展

侯風剛

血管生成擬態（vasculogenic Mimicry，VM）是近年來提出的一個腫瘤微循環的全新概念。與經典的血管生成途徑完全不同，VM 是高侵襲性腫瘤為了滿足自身的血液供應，通過自身表型和細胞外基質重塑而圍成的一種類血管樣的管道，是不依賴血管內皮細胞的一種腫瘤微循環模式，VM的發現解釋了以抑制腫瘤血管生成為主要作用靶點的抗腫瘤治療效果不佳的原因。自 1999年Maniotis 發現黑色素瘤組織中存在 VM 以來，人們開始認識到內皮細胞依賴的腫瘤血管生成并不是腫瘤唯一的微循環模式，在抑制腫瘤微循環的治療中兼顧 VM 與血管生成，尤其重視 VM 的治療才能獲得良好療效。盡管 VM 形成機制還尚未完全明確，但相關研究仍取得了很大進展，這對于尋找抑制 VM的關鍵作用靶點，篩選有效的 VM 治療藥物，提高腫瘤療效有著重要的現實意義。現將近年來 VM 形成機制的研究做一綜述。

1 腫瘤細胞的“可塑性”

Maniotis 在發現 VM 的同時，注意到高侵襲性與低侵襲性的人黑色素瘤細胞在形成 VM 的能力上存在明顯差異，推測可能是兩種細胞在基因表達上存在差異[1]。Seftor等[2]隨后發現，高侵襲性黑色素瘤 MUM-2B 細胞可形成VM，而低侵襲性黑色素瘤 MUM-2C 細胞很難形成 VM，兩者共有多達 210 個基因表達不同，MUM-2B 分子標志與多能胚胎樣基因型非常相似。Hendrix 等[3]也發現高侵襲性黑色素瘤 VM 形成過程中腫瘤細胞能同時表達多種基因，包括上皮細胞、內皮細胞、成纖維干細胞等細胞表型的特異基因，而其本身特異的分化標記表達顯著下調，說明高侵襲性黑色素瘤細胞能發生表型改變，呈現多潛能胚胎干細胞的屬性。研究還發現這種腫瘤細胞在三維培養中形成 VM 管道樣結構的過程與胚胎時期原始血管網的形成非常相似，而且高表達血管上皮鈣黏附素（VE-cadherin，VE-cd）等胚胎時期血管發育密切相關基因，因而推測 VM 的發生“重演”了胚胎時期血管形成過程[4]。Mourad-Zeidan 等[5]發現在黑色素瘤 VM 形成過程中腫瘤細胞會發生表型重塑，可以表達 VE-cd、白細胞介素 8（interleukin-8，IL-8）、內皮分化基因 1（endothelial differentiation gene 1，EDG1）、纖維連接蛋白 1（fibronectin-1，FN-1）、基質金屬蛋白酶 2（matrix metalloproteinase，MMP-2）等內皮細胞標記物，為上述的推測提供了有力的支持。目前已明確大多數腫瘤都能形成VM 的結構，而除了黑色素瘤細胞以外，其他腫瘤的腫瘤細胞也能在 VM 形成過程中出現表型的“可塑性”，如膀胱癌細胞能在三維培養下表達多種內皮相關標記因子，并形成類似血管的管網狀結構，說明其具有內皮細胞的一些特征，能模擬內皮細胞形成腫瘤微循環結構[6]。最新研究表明，對能夠形成 VM 結構的神經膠質瘤細胞進行細胞特性研究，發現這些細胞有某些干細胞特性，具有多向分化的能力[7]。這些研究充分表明，在 VM 形成過程中腫瘤細胞能夠去分化逆轉為多潛能胚胎干細胞表型，表現出很強的可塑性，這可能是 VM 形成的一個非常重要的機制。

2 腫瘤細胞微環境改變

近年來的研究表明，腫瘤細胞微環境改變在 VM 形成過程中也起著重要作用。研究發現，缺氧可以促進 VM 形成。Hendrix 等[8]認為，缺氧環境使包括高侵襲性黑素瘤細胞在內的惡性腫瘤細胞基因型發生改變，塑形性明顯提高，并選擇性地表達某些血管內皮相關細胞基因，使其能夠作為血管內皮樣的細胞參與 VM 形成。在實驗中，他們將侵襲性黑色素瘤細胞植入缺血的裸鼠后腿肌肉中，5 d 后 VM生成，20 d 后隨著缺血區新生血管的生成 VM 逐漸減少至消失，說明腫瘤微環境對 VM 形成確有影響。Sun 等[9]也發現黑色素瘤細胞在缺氧微環境中缺氧誘導因子 HIF-1α表達增加，并誘導 VM 管道形成以獲得足夠供氧。在胃腺癌和卵巢上皮癌細胞中，也有類似發現[10-11]，同時還發現，抑制缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達，就可阻斷 VM 形成[11]。這些研究表明缺氧不但可以促進惡性腫瘤 VM 的形成，而且很可能是誘發腫瘤細胞形成 VM 的一個重要始動因素。

腫瘤細胞外基質（ECM）重塑是 VM 形成過程中的一個重要改變，眾多研究表明，基質金屬蛋白酶（MMPs）、層黏連蛋白（LN）及其分解產物對于腫瘤細胞外基質重塑起著重要作用。在 VM 早期研究中，有學者就通過侵襲性卵巢癌 VM 基質的免疫組化分析發現[12]，基質金屬蛋白酶在 VM 網絡周圍大量分泌，加入金屬蛋白酶抑制劑可以抑制 VM 形成。LN5γ2、MMP-2 和mmP-14 對于 VM 形成是非常重要的[13]，其機制可能是腫瘤細胞過度表達 LN和基質金屬蛋白酶（MMPs），同時細胞表面 LN 受體也增多，黏附更多的 LN，活化的mmP 將 LN 分裂成 2γ 和2γx 片段，沉積于細胞外，促進 VM 形成。Hendrix 等[14]在培養過轉移性黑素瘤細胞的、含有豐富的 LN5γ2 鏈及其被mmP 分解后形成的 γ2' 鏈和 γ2x 鏈的三維基質中，加入低侵襲性的黑素瘤細胞后，低侵襲性瘤細胞也可以被誘導表達血管形成和基質重構的基因，形成血管生成擬態，提示細胞微環境中的 LN5 γ2 鏈及其產物 γ2' 鏈、γ2x 鏈對血管生成擬態有促進作用。在另一個實驗中，將不能形成 VM的低侵襲性黑素瘤細胞置于曾經培養過高侵襲性黑素瘤細胞的基質中進行三維培養，發現低侵襲性細胞的基因表達發生了顯著變化，并產生了 VM；當去除這種基質后，低侵襲性細胞則失去形成 VM 的能力[15]。這說明高侵襲性黑色素瘤細胞能產生 VM 形成所需的物質。Folberg 等[16]進一步提出高侵襲性黑色素瘤能產生 Laminin、IV 型膠原、VI型膠原和纖維結合蛋白，而這些物質構成了 VM 增殖所需的細胞外基質微環境，而細胞外基質微環境的這些變化能誘導 VM 的產生，說明腫瘤細胞外基質重塑也參與了 VM形成。所有這些研究均證實腫瘤細胞與細胞外基質之間相互作用，促進了腫瘤細胞外基質重塑，從而導致了 VM 形成，這可能是 VM 形成的另一個重要機制。因此，關于腫瘤VM 的形成，我們可以推測，一些腫瘤細胞在細胞周圍環境改變如缺氧的情況下，細胞表型發生重塑，并影響細胞外基質重構，最終導致腫瘤 VM 形成。

3 VM 形成分子機制

腫瘤 VM 形成的分子機制目前尚不完全清楚，但眾多研究表明，這一機制是十分復雜的，可能與多種調控因子、多種調控路徑有關。

VE-cd 是一種公認的、內皮特異性的 Ca2+依賴跨膜蛋白，介導細胞與細胞相互黏附，屬于鈣粘素家族成員，正常情況下，由內皮細胞特異表達，集中分布在內皮細胞連接處，是胚胎時期內皮細胞發生重新排列形成管道結構的重要分子條件，大量研究表明，VE-cd 在 VM 形成過程中扮演著關鍵角色。近年來發現 VE-cd 是很多 VM 調控因子的靶分子，這些物質通過調控 VE-cd 而起作用。Twist1 是上皮細胞間葉樣變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的重要調控因子，對于腫瘤侵襲和轉移有明確地促進作用，研究發現[17]，Twist1 上調可以上調 VE-cd 表達，從而促進肝癌細胞形成 VM。螺旋環螺旋 DNA 結合抑制因子-2（inhibitor of DNA binding 2，Id2）是 HLH 蛋白家族的重要成員之一，在多種細胞的分化與轉錄調控中發揮著相當復雜的作用，與腫瘤細胞增生、分化、凋亡、侵襲等密切相關。研究表明[18]，Id2 在人眼色素層黑色素瘤細胞形成 VM 的分子調控中起一定作用，這種作用也主要是通過上調VE-cd 表達來完成的。半乳糖凝集素-3（Galectin-3,Gal-3）即 β 半乳糖苷結合蛋白，是涉及腫瘤生長和轉移的一種物質，在黑色素瘤細胞 VM 形成過程中也起著重要作用，cDNA 微陣列分析表明，Gal-3 通過調節 VE-cd 等內皮細胞標記物基因的表達，引起黑色素瘤細胞表型重塑，促進VM 形成[5]。

研究表明[3,19-20]，EphA2 在 VM 形成中也起著重要作用，是調控 VM 形成的另一個關鍵物質。作為VE-cd 的下游調控因子，EphA2 與 VE-cd 關系密切，并且可能影響多個信號傳導通路促進 VM 形成。研究認為[21-22]，VE-cd能在相鄰黑色素瘤細胞間同型結合，使上皮細胞激酶（EphA2）局限于細胞膜上，與相鄰細胞膜配體 ephrin-Al相結合發生磷酸化，磷酸化的 EphA2 與 FAK 在細胞膜上相互作用，引起 FAK 磷酸化和活化，而 FAK 的磷酸化通過 MapK 通路，特別是 MEKI/2—Ekrl/2 通路，激活尿激酶活性，促進 VM 形成。在這個通路上阻斷 VE-cd、EphA2、FAK 任何一點均可明顯降低腫瘤細胞形成 VM 的能力。蛋白酪氨酸激酶（PTKs）與腫瘤細胞黏附、遷移和侵襲等過程中信號傳導蛋白的磷酸化密切相關，作為EphA2 的配體，PTKs 活化也可以導致腫瘤 VM 形成。Hess 等[23]發現，PTKs 表達在高侵襲性黑色素瘤中明顯升高，其活性在 VM局部有所增加，而其受體 EphA2 也特異性地表達，抑制PTKs 活性或者敲除 EphA2 基因均可明顯抑制 VM 產生，說明 PTKs 引起的信號轉導蛋白磷酸化對 VM 形成非常重要，而 EphA2 作為受體與 PTKs 相互作用，參與了信號轉導蛋白磷酸化的過程，最終導致 VM 形成。

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號通路在腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、黏附方面均起著重要調節作用，與腫瘤血管生成以及細胞外基質的降解等也密切相關，近年來發現 PI3K 在腫瘤 VM 形成中也起重要作用，而這種作用與其參與調控腫瘤細胞外基質重塑有關。Hess 等[24]發現在黑色素瘤細胞形成 VM 的過程中，PI3K 調節膜型-基質金屬蛋白酶 1（membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP/MMP-14）的功能，MT1-MMP 在金屬蛋白酶組織抑制因子-2（tissue inhibitor ofmmP-2，TIMP-2）的協同作用下活化mmP-2，活化的mmP-2 分解層黏連蛋白 5γ2鏈為γ2' 和 γ2x 片段，沉積于腫瘤細胞外基質中，促進VM 形成；應用 PI3K 特異性抑制劑可抑制 VM 的發生。隨后的研究還發現，在腫瘤 VM 網狀結構染色區中LN-5γ2 鏈及mmPs 高表達，應用 LN-5γ2 鏈反義寡核苷酸、MMP-2 或 MT1-MMP 抗體均可有效抑制 VM 發生[22]。這些表明 PI3K/MMPs/LN 是 VM 形成的一條重要的調控路徑。

除了上述機制以外，近年來還發現了多種與 VM 形成有關的調控因子。研究發現，組織因子途徑抑制因子 2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）的相關基因表達水平在高侵襲性黑色素瘤細胞中可明顯增高，同時，將低度侵襲性黑色素瘤細胞培養在含有重組組織因子途徑抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2）的三維基質中，低侵襲性腫瘤細胞能夠轉換為高度侵襲性細胞并呈現出內皮細胞的表型，產生一些血管樣通道；阻滯 TFPI-2 可抑制mmP-2 的活性，并能阻止上述血管樣通道的形成，提示 TFPI-2 可能是侵襲性黑色素瘤 VM 形成的某種途徑上的一個重要調節物[25]。另外，研究表明，COX-2 參與調節了乳腺癌 VM 的形成[26]，血管內皮生長因子（VEGF）[27]與骨肉瘤、卵巢癌 VM 形成有關，CD147（細胞外mmP誘導物）則對卵巢癌 VM 形成起調控作用[28]，而遷移誘導蛋白-7（Mig-7）則對黑色素瘤 VM 形成起重要調控作用[29-30]。最新研究還發現，用 siRNA 技術下調神經膠質瘤細胞（brain-expressed X-linked gene 2，BEX2）基因能明顯抑制 VM 形成，推測 BEX2 很可能是神經膠質瘤 VM 形成的重要調控因子[31]。這些研究，雖然還不能完全闡明 VM形成的分子機制，但可以肯定的是，腫瘤 VM 的形成機制尤其是分子機制是十分復雜的，是一個多因子參與調控的、多路徑發展的過程，同時，一些調控因子很可能對某些腫瘤VM 的形成起著關鍵調節作用，有可能成為抑制或阻斷腫瘤 VM 形成的關鍵作用靶點。

4 展望

目前已經初步明確 VM 是某些高侵襲性腫瘤細胞與細胞以及與 ECM 間相互作用導致細胞表型和 ECM 重塑所導致的。從當前研究來看，VM 的形成很可能是一個由多種因素誘導的、多因子參與的、眾多信號傳導通路控制的復雜過程，很多機制還需要進一步探索。例如：這些細胞與腫瘤干細胞和胚胎干細胞之間有什么關系？這些細胞的表型變化的關鍵調控因子或調控路徑是什么?ECM 的主要成分在重塑過程中是如何變化的，哪些是導致 ECM 重構的關鍵因子，又是什么原因引起這些關鍵的因子產生了變化？相信隨著研究不斷深入，這些問題都能得到很好地闡明，從而為腫瘤治療的研究提供更好的理論支持。

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