自噬體的檢測及其對腫瘤的作用

齊亞莉,王 俊,李 巖,王洪艷,龔守良

(1.吉林大學公共衛生學院衛生部放射生物學重點實驗室,吉林長春130021;2.北華大學公共衛生學院,吉林 132001;3.吉林市腫瘤醫院放療科,吉林 132001)

1 自噬的概述

1.1 自噬(autophagy)簡介 自噬來源于希臘詞匯,意思是“self”和“eating” ,用來描述細胞在饑餓時,為了存活而降解細胞內成分獲得營養。自噬是真核細胞蛋白降解的重要途徑,其作用主要是清除降解細胞內受損傷的細胞結構、衰老的細胞器及不再需要的生物大分子等,同時也為細胞內細胞器的構建提供原料,即細胞結構的再循環。細胞對這種合成與降解的精細調節,對維持細胞的自身穩態有重要意義。

1.2 自噬的發生過程 自噬開始于細胞質內半環狀雙層或多層膜結構的形成,進而包繞大量細胞質和細胞器(如線粒體、內吞體、過氧化物酶體等),形成自噬體(autophagosome),其直徑一般為300-900 nm,平均500 nm。包裹膜可能源于粗面內質網的無核糖區、反面高爾基網絡或其它有膜囊泡體。自噬體膜相關蛋白的缺乏是從酵母到哺乳動物的共同特征,故難以確定自噬體膜的起源。自噬體與溶酶體融合,成為自噬溶酶體(autophagolysosome),最終通過溶酶體內的蛋白酶降解其內成分,完成對包裹物質的降解和再循環利用。

1.3 自噬分類 根據細胞物質運到溶酶體內的途徑不同,自噬可分為以下3類。

1.3.1 大自噬 多數人認為是由內質網來源的單層膜凹陷形成杯狀雙層膜樣的分隔膜,進而完全包繞待降解物形成自噬體,接著與溶酶體融合,自噬體內細胞物質(如細胞器)被溶酶體酶溶解。

1.3.2 小自噬 小自噬是溶酶體的膜直接包裹如長壽命蛋白并在溶酶體內降解。

1.3.3 分子伴侶介導的自噬(CMA)胞漿內蛋白結合到分子伴侶后被轉運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白分子,所以CMA降解途徑在清除蛋白質時有選擇性,而前二者無明顯的選擇性。

1.4 自噬主要有3種作用

1.4.1 自噬是對營養缺乏的一種適應性反應,如氨基酸缺乏在肝臟和培養細胞中可以誘導自噬。自噬對大分子物質的降解能夠產生調節新陳代謝和生物合成的氨基酸及其它因子,為細胞提供能量,維持細胞的生命活動。氨基酸是自噬的重要調節因子,缺失氨基酸在肝臟中迅速誘導自噬,最初可觀察到自噬體,經歷7-8 min后降解液泡出現。從自噬體的形成到轉化成殘余體這一完整自噬進程約需20 min,營養缺乏的肝細胞中自噬途徑對胞質蛋白這種非選擇性的降解率為3%-4%/h[1]。

1.4.2 自噬能夠調節過氧化物酶體、線粒體和內質網的更新,故自噬被認為是一種參與細胞質穩態的看家機制,在許多病理生理和應激刺激狀況下可觀察到對這些細胞器選擇性的分隔。

1.4.3 自噬參與特定的組織特異性功能。自噬與肺泡表面活性劑Ⅱ生物合成有關。黑質多巴胺能神經元神經黑色素的生物合成應歸于胞質多巴胺-苯醌被分隔入自噬液泡。在紅細胞成熟過程中,細胞核排出后需要自噬清除核糖體和線粒體等細胞器。

1.5 自噬的發生過程可分為4個階段

1.5.1 啟動階段 啟動階段是隔離膜形成的階段。在饑餓及某些激素等因素刺激下,有雙層膜的杯狀分隔膜開始在被降解物的周圍形成。

1.5.2 延長階段 此階段即隔離膜彎曲、變大,形成吞噬體膜以包裹吞噬的成分。

1.5.3 成熟階段 在此階段,自噬體形成之初,胞質與核質變暗,但細胞核結構無明顯變化,可見線粒體和內質網膨脹,高爾基體增大,胞膜特化結構(如微絨毛、連接復合物等)消失,胞膜發泡并可出現內陷。自噬后期,自噬體的體積和數量都有所增加,其內常充滿髓脂或液體,胞質中可見灰白成分,少數可見核固縮。

1.5.4 自噬體的裂解 自噬體形成后,將其包裹物運輸至溶酶體內與溶酶體融合形成自噬溶酶體,這一過程并非簡單的擴散,而是通過細胞骨架微管網絡系統的傳輸實現的。自噬體融合后,最終被溶酶體中的水解酶溶解,首先經過囊泡酸化,達到所需pH值后經多種蛋白酶作用使囊內容物降解,降解產物在細胞內再循環利用。

1.6 自噬體的檢測

1.6.1 以透射電子顯微鏡下超微結構的形態學檢測(俗稱檢測自噬體的金標準)。在透射電子顯微鏡下可見損傷的細胞器如線粒體的腫脹變性,其周圍出現空泡狀雙層膜樣結構,繼而雙層膜環繞成自噬體,進而與溶酶體融合、消化;也可見自噬溶酶體內最終不能降解的殘體等[2]。

1.6.2 自噬體膜標志性蛋白質的檢測。自噬體膜上標志性蛋白質有Atg12與Atg5結合體和微管相關蛋白1的輕鏈3(LC3)。Atg12和Atg5在翻譯后就像單個分子一樣共價結合在一起,定位在自噬體雙層隔離膜的整個延長階段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳動物中的同源物,和前者相比,LC3除了定位在自噬體分隔膜上,也一直以和磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結合的形式(LC3-PE)存在于自噬體形成各階段的內外膜上,在自噬溶酶體膜上也可見[3]。通過與綠色熒光蛋白(GFP)結合成Atg12-Atg5-GFP、LC3-GFP,即可實現對自噬體的檢測。LC3是目前檢測自噬的唯一標志蛋白,有兩型,LC3-Ⅰ分子量為18 kDa,LC3-Ⅱ分子量為16 kDa,可檢測其含量和比值以反映細胞自噬活性。

1.6.3 單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。此法是自噬發生過程中分析分子水平機制的一種特異的檢測自噬體方法[4]。自噬體形成依賴的第二個泛素樣結合系統(Atg8)是位于自噬囊泡膜上與MDC特異結合的生化標志,通過熒光染色,在熒光顯微鏡下可見核周區域陽性顯色。

1.6.4 應用LC3-Ⅱ/DNA雙參數流式細胞術對細胞自噬與細胞周期進行同步分析,既可以檢測細胞自噬的發生,又可以與細胞周期進行同步分析,闡明細胞自噬的發生與細胞周期的關系,同時也建立了一種新的檢測自噬的方法[5]。

1.6.5 間接自噬體檢測法。自噬溶酶體及其不能降解的產物殘體的檢測。自噬體和溶酶體融合后,除上述的LC3-GFP法檢測外,還有吖啶橙染色法,是一種熒光染料作為非極性反膠態分子團的分子探針,在自噬溶酶體內酸性磷酸酶活性增強下顯著著色。對殘體的檢測主要是對脂褐素顆粒的顯微觀察。

2 自噬在腫瘤中的作用

2.1 腫瘤細胞中自噬活性的降低 在對不同腫瘤細胞發展過程的研究中發現,有些腫瘤細胞,如化學致癌物導致的肝癌細胞,在癌變前期的肝結節時就已經出現了自噬能力下降的現象;而鼠的胰腺細胞經致癌物質誘導后,在癌變前期的結節和形成腺瘤時自噬和降解能力增加,當形成癌細胞時自噬能力反而減少[6]。這些例子說明,大多數腫瘤細胞(如肝臟、胰腺和乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同,但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自噬能力的衰退可能有利于腫瘤的發展。這提示,腫瘤細胞能快速生長,是由于其打破了細胞蛋白質合成速率與自噬體降解蛋白質的平衡[7]。

2.2 腫瘤細胞中的高自噬活性 盡管大多數腫瘤細胞的自噬活性都降低,但是仍然有一些腫瘤細胞保持了較高的自噬活性,如大腸癌、肺癌細胞及人宮頸癌HeLa細胞等。研究表明,在缺乏血清或氨基酸的情況下約3 h,HeLa細胞中的自噬部分從4%上升到37%。這些腫瘤細胞所具有的高自噬活性對腫瘤細胞在惡劣環境中的生存起到了一定的保護作用,也可能使一些腫瘤藥物的作用減弱[8]。

2.3 自噬可作為腫瘤抑制因子 抑制自噬可使蛋白降解減少,合成代謝增加,導致癌前病變細胞的持續性生長。與相應正常細胞相比,腫瘤細胞和轉化細胞自噬能力明顯下降,例如,轉化的成纖維細胞蛋白降解速率低于未轉化者,特別是在營養和(或)血清缺失的狀況下。在致瘤動物實驗中也觀察到自噬能力的下降,二乙基亞硝胺誘導的原發性肝癌,癌前結節自噬能力較正常肝細胞下降,正常肝細胞經種植瘤大鼠腹水作用后,自噬性蛋白降解被完全抑制。而且,從肝結節和肝細胞肝癌中分離出的細胞在培養中較正常肝細胞在氨基酸缺失的狀況下存活良好。根據這些資料,Schwarze等[9]提出自噬下調導致生存優勢是因饑餓而防止蛋白過度丟失,蛋白平衡提高的結果。在體內,相較于正常肝細胞,在氨基酸濃度波動的饑餓應激下,通過降低自噬維持正蛋白平衡能夠使癌前病變細胞獲得克隆優勢。

2.4 保護腫瘤細胞的作用 自噬除了抑制腫瘤的作用外,作為細胞的保護機制之一,還具有保護腫瘤細胞的作用。例如,使用 100 μ mol/L替莫唑胺(temozolomide)處理惡性膠質瘤細胞U3732MG,3 d后可以看到細胞中有明顯的自噬特征性改變,而且細胞的增殖受到抑制,但作用7 d后卻發現細胞開始增殖[10]。這說明,替莫唑胺誘導的自噬是可逆的,而且這種自噬可以保護腫瘤細胞,防止其死亡。Yan等[11]研究了響尾蛇對白血病K-562細胞的作用,發現自噬可以延緩凋亡,維持細胞活力。Paglin等[12]發現,結腸癌、乳腺癌及前列腺癌細胞在接受小劑量放療后,均存在酸性囊泡樣細胞器(AVO,即自噬泡)堆積現象。事實上AVO是保護照射后細胞的一種防御機制,因為抑制AVO后,輻照細胞的死亡率升高。有人推測,自噬是凋亡的早期反應,當細胞的損傷超過自噬保護負荷后,線粒體的準凋亡因子將激活細胞死亡程序,因此提高自噬能力可減輕或者避免因凋亡所引起的死亡。

2.5 雙重作用 由此可見,自噬在腫瘤中的作用是雙重的,作為腫瘤保護機制,自噬可以保護癌細胞免受藥物的攻擊;作為腫瘤抑制機制,自噬可以導致細胞死亡、限制細胞數量,或者減少DNA的突變概率,以防止腫瘤形成。

[1]溫瑩浩,殷正豐.自噬與腫瘤[J].實用腫瘤雜志,2006,21(5):482.

[2]Martinet W,De Meyer GR,Andries L,et al.In Situ Detection of Starvatiorr induced Autophagy[J].J Histochem Cytochem,2005,7:[Epub ahead of print].

[3]Bergamini E,Cavallini G,Donati A,et al.The role of macroautophagy in the ageing process,anti-ageing intervention and age-associated diseases[J].Int J Biochem Cell Biol,2004,36(12):2392.

[4]Biederbick A,ken HF,Elsasser HP.Minidansylca daverine(MDC)is a specific in vivo marker forautophagic vacuoles[J].Eur J Cell Biol,1995,66(1):3.

[5]韓中博,張 鵬,付 強,等.腫瘤細胞自噬的誘導及其細胞周期分析[J].癌癥,2006,25(9):1063.

[6]Toth S,Nagy K,Palfia Z,et al.Cellular autophagic capacity changes during azaserine induced tumour progression in the rat pancreas Up-regulation in all premalignant stages and down-regulation with loss of cclohexinide sensitivity of segregation along with malignant transformation[J].Cell Tissue RES,2002,309(3):409.

[7]林 芳,顧振綸,秦正紅.自噬及其在細胞代謝和疾病中的作用[J].生物化學與生物物理進展,2005,32(4):298.

[8]Cuervo AM.Autophagy.In sickness and in health[J].Trends Cell Biol,2004,14(2):70.

[9]Schwarze PE,Seglen PO.Reduced autophagic activity,improved protein balance and enhanced in vitro survival of hepatocytes isolated from carcinogen treated rats[J].Exp Cell Res,1985,157(1):15.

[10]Bauvy C,Gane P,Arico S,et al.Autophagy delays sulindac sulfide-induced apoptosis in the human intestinal colon cancer cell line HT-29[J].Exp Cell Res,2001,268(2):139.

[11]Yan CH,Liang ZQ,Gu ZL,et al.Arsenic trioxide induces autophagic cell death inmalignant glioma cells by unregulation or mitochondrial cell deaty protein BNIP3[J].Oncogene,2005,24(6):980.

[12]Paglin S,Hollister T,Delohery T,et al.A novel response of cancer cells to radiation involves autophagy and formation of acidic vesicles.Cancer Res,2001,61(2):439.