高效液相色譜法測(cè)定霉酚酸含量及有關(guān)物質(zhì)

劉勝興 林芹

（1.廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司 廣西 南寧 530003; 2.廣西中醫(yī)學(xué)院制藥廠 廣西 南寧 530023）

高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”等，是一種高壓、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、分析速度快的分離分析技術(shù)。在中國(guó)藥典中主要用于藥物的含量測(cè)定、有關(guān)物質(zhì)檢查和鑒別等。天然藥物的來(lái)源有動(dòng)物、植物和礦物之分。由于化學(xué)成分復(fù)雜，有效成分可能有一個(gè)，也可以有多個(gè)，因此精確測(cè)定各有效成分的含量對(duì)藥品質(zhì)量控制，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的意義。高效液相色譜法可對(duì)天然藥物的成分進(jìn)行分離鑒定，并測(cè)定有效成分的含量。

霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)是一種高效、選擇性、非競(jìng)爭(zhēng)性、可逆性的次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶抑制劑，可抑制鳥(niǎo)嘌呤核苷酸的合成途徑。MPA有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法作者未見(jiàn)國(guó)內(nèi)報(bào)道。本文采用高效液相色譜法對(duì)MPA的含量及有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行研究試驗(yàn)，建立了霉酚酸的HPLC測(cè)定方法，可同時(shí)測(cè)定含量、分離有關(guān)物質(zhì)，為原料質(zhì)量控制建立標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與實(shí)驗(yàn)藥品

Waters600-717-2487型高效液相色譜儀。霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，Sigma公司)，霉酚酸原料由本廠提供；乙腈，甲醇為色譜純；三乙胺，磷酸為分析純。

2 色譜條件

采用phenomenexC8色譜柱（250mm×4.6μm×5μm），流動(dòng)相：三乙胺磷酸緩沖液（取超純水980mL，加入三乙胺20mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.6，攪拌至完全溶解）乙腈（60∶40）,檢測(cè)波長(zhǎng)250nm,流速：1.0mL/min。

3 方法與結(jié)果

用本色譜系統(tǒng)檢測(cè)霉酚酸有關(guān)物質(zhì)，色譜圖如下，各雜質(zhì)峰均能與霉酚酸主峰的達(dá)到良好的分離。試驗(yàn)表明，本品在酸、堿、氧化、高溫及光破壞均不穩(wěn)定，降解后的雜質(zhì)峰也均能與霉酚酸主峰達(dá)到良好的分離 。

（1）精密度。選取適量的霉酚酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密測(cè)量，用甲醇制成的供試液0.4mg/mL進(jìn)行搖勻，之后按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算霉酚酸峰面積值，RSD為0.2%。結(jié)果：精密度良好。

（2）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。選擇適量相同批號(hào)的霉酚酸樣品并且稱(chēng)取相同的6份，用甲醇制成的供試液0.4mg/mL進(jìn)行搖勻，按之前的步驟進(jìn)行測(cè)定，6份溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣10uL，結(jié)果得到含量的RSD值為0.52%。

（3）溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。選取相同的霉酚酸供試液1份，在0,4,8,12h分別測(cè)定霉酚酸的峰面積值以考察試品的溶液穩(wěn)定性，其中RSD為0.96%。結(jié)果說(shuō)明樣品供試液在12min內(nèi)基本穩(wěn)定。

(4)線性實(shí)驗(yàn)。稱(chēng)取霉酚酸適量，用甲醇制成供試液800.48ug/mL，分別取溶液6.0、5.5、5.0、4.5、3.5、2.5mL置于15mL的容器中，并用甲醇溶液定容至刻度，得到不同濃度的溶液分別為479.32、445.56、397.56、358.24、279.54、201.45μg/mL，然后分別進(jìn)樣15uL，并記錄下色譜圖，結(jié)果顯示霉酚酸濃度在201.45～479.32μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

（5）回收率實(shí)驗(yàn)。稱(chēng)取霉酚酸適量并且以對(duì)照品溶液進(jìn)樣，按峰面積計(jì)算樣品回收率，測(cè)得回收率平均值為98.69%。在統(tǒng)一的色譜條件下，測(cè)得最低檢測(cè)限為0.1ng（S/N≥3）。通過(guò)上述方法檢測(cè)不同批原料結(jié)果為02001含量為98.2%，雜質(zhì)為0.41%；02001含量為98.9%，雜質(zhì)為0.65%；02003含量為97.9%，雜質(zhì)為0.54%。

4 討論

霉酚酸在C8柱上易產(chǎn)生前沿峰。不同品牌C8柱，保留時(shí)間、峰形有較大的差異。考察各種配比的流動(dòng)相，25cm的長(zhǎng)柱有利于達(dá)到較好的分離效果，分離度>1.5，分離效果好。本方法，霉酚酸的出峰時(shí)間快，峰形較好，同時(shí)此方法靈敏，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于霉酚酸原料含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

高效液相色譜法是現(xiàn)代藥物分析中最高效、快捷的方法之一，具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，既可用于藥物分離，也可用于定性定量分型，適用范圍廣因此在藥物成分的分離與測(cè)定方面能夠充分發(fā)揮其它分析方法無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。而且隨著計(jì)算機(jī)軟件的開(kāi)發(fā)、專(zhuān)家系統(tǒng)的應(yīng)用、檢測(cè)手段的進(jìn)步、各種聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)以及其他一些相關(guān)問(wèn)題的解決，HPLC將稱(chēng)為今后質(zhì)量規(guī)范化，國(guó)際化的重要途徑之一。

[1]徐蓉，胡輝，朱健.新型免疫抑制抗生素霉酚酸酯的研究進(jìn)展[N].溫州大學(xué)學(xué)報(bào),2005.

[2]李發(fā)美，于治國(guó)，陳發(fā)奎，等.醫(yī)藥高效液相色譜技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1999.