當歸多糖的超聲提取及含量測定

何先元，許晉芳，王秋霜，陳媛媛

(重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 401331)

當歸為傘形科植物當歸 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，為中醫傳統常用補血藥，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功效，用于治療血虛萎黃、眩暈心悸、月經不調、經閉痛經、虛寒腹痛、腸燥便秘、風濕痹痛、跌撲損傷、癰疽瘡瘍[1]。當歸的主要成分為阿魏酸、揮發油糖、多糖等。現代藥理學研究表明，當歸多糖具有多種免疫活性，對造血系統有明顯作用，對抗腫瘤、抗輻射損傷也有較好的療效。筆者以超聲提取-分光光度法測定當歸多糖含量，為其開發利用提供參考[2-4]。

1 儀器與試藥

WFZ UV-2000型紫外光分光光度計(龍尼科上海儀器有限公司);SK8200H型超聲儀(上海科島超聲儀有限公司);KQ-5200DA型超聲波清洗儀(江蘇昆山);TDZ 4A-WS型低速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司);CS 101-2EBN型電熱鼓風干燥箱(重慶永生);HZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)。葡萄糖對照品(分析純，105℃干燥至恒重);當歸供試品(粉碎成粗粒，過40目篩，60℃烘3 h);乙醇(80%，95%)、5%苯酚、硫酸、石油醚、氯仿、1%活性炭、無水乙醇、乙醚、丙酮均為分析純。

2 方法與結果

2.1 當歸多糖的提取與精制

稱取當歸200 g，置圓底燒瓶中，加石油醚500 mL，75℃回流1 h脫脂，過濾，殘渣揮干溶劑，然后用80%的乙醇500 mL浸漬過夜，超聲提取2次，每次1 h，過濾，藥渣加蒸餾水1 000 mL浸漬1 h，超聲提取30 min，過濾，再加500 mL蒸餾水，超聲提取30 min，過濾，合并濾液，減壓濃縮至150 mL，用氯仿萃取3次，以除去蛋白質。加1%活性炭脫色2次，抽濾，濾液加乙醇使含醇量達80%，于冰箱中靜置過夜，過濾，殘渣先后用95%乙醇、無水乙醇、乙醚、丙酮依次洗滌，60℃ 烘干至恒重，即得精制當歸多糖。

2.2 溶液制備

精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖對照品25.0 mg，置250 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，即得對照品溶液。取苯酚100 g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.2 g，蒸餾，收集182℃餾分5 g，加100 mL蒸餾水溶解，置棕色試劑瓶中，制成5%苯酚溶液，冷藏待用。取樣品粉末(過40目篩)，60℃下干燥3 h，精密稱取0.262 9 g，置錐形瓶中，加80%的乙醇50 mL，超聲提取30 min，過濾，殘渣及濾紙加蒸餾水80 mL，超聲提取30 min，濾過，再加水80 mL超聲提取30 min，殘渣及濾紙用水洗滌(15 mL×4次)，洗液并入濾液，合并兩次提取液，然后定容于250 mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 換算因子測定

精密稱取60℃下干燥至恒重的精制當歸多糖14.3 mg，置50 mL量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻后作為貯備液。精密吸取貯備液2 mL，按標準曲線繪制方法操作，用回歸方程求出多糖供試品溶液的葡萄糖質量濃度，按公式 f=W/(C·D)計算。式中 W為多糖的質量(μg)，C為多糖稀釋液中葡萄糖的質量濃度(μg/mL)，D為多糖的稀釋因子。換算因子 f=36.08。

2.4 方法學考察

標準曲線繪制:精密吸取對照品溶液 0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1 mL，分置50 mL具塞試管中，依次加蒸餾水補足至2 mL，各管再加5%苯酚溶液1.6 mL，搖勻，迅速加濃硫酸6 mL，常溫放置25 min，于490 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，以吸光度(A)對葡萄糖質量濃度(C)進行回歸，得回歸方程 Y=0.691 7 X-0.0971，R2=0.9776(n=6)。

穩定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0，1，2，4，8，24 h時依法測定其吸光度。結果的 RSD為3.13%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

精密度試驗:精密吸取對照品溶液，依法重復測定吸光度。結果的 RSD為0.86%(n=5)。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量的樣品粉末0.122 2 g，精制當歸多糖31.7 mg，置同一錐形瓶中，按供試品溶液制備及含量測定方法操作，計算含量及回收率。結果回收率范圍為98.44%～99.90%，平均回收率為99.85%，RSD為0.80%(n=3)。

2.5 樣品含量測定

精密吸取供試品溶液2 mL，按標準曲線繪制項下方法操作，測定吸光度，用回歸方程求出葡萄糖含量，計算樣品中多糖含量。多糖含量(%)=C·D·f/W×100%，式中 W為供試品的質量(μg)，C為供試品溶液中葡萄糖的質量濃度(μg/mL)，D為供試品的稀釋因子，f為換算因子。結果平均相對百分含量為12.45%，RSD為2.04%(n=6)。

3 討論

當歸的多糖含量較高，作為免疫調節劑和抗放射損傷劑，多糖已應用于臨床，但多以粗多糖的形式被利用，質量難以控制，藥效重復性差，不符合國際規范。當歸在我國屬于大宗藥材，產地多，有野生的，也有種植的，種植技術、采收時間等也有差異，這些因素導致當歸有效物質存在差異。在以當歸多糖作為藥用成分應用時，如何分離、提取和高效快速檢測當歸多糖是當歸藥材質量控制要解決的重大問題。超聲提取-分光光度法是先用80%乙醇提取，以除去單糖、低聚糖、苷類及生物堿等成分，再用超聲水提取多糖成分;多糖類成分在硫酸的作用下，先水解成單糖分子并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后和苯酚合成有色化合物，用比色法測定其含量。超聲提取方法縮短了提取時間，簡便快捷，具有分離效果好、靈敏準確、重現性好等優點，且含量測定顯色穩定，多糖水解較完全，故本研究采用此法測定當歸多糖的含量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:89-174.

[2]南換杰，秦雪梅，武 濱，等.潞黨參多糖的超聲提取和含量測定[J].山西醫科大學學報，2008，39(7):641-643.

[3]劉 云.當歸多糖的提取及含量測定[J].現代中藥研究與實踐，2003，17(1):49，53.

[4]胡小平，李玉云，李先何，等.當歸多糖的成分及藥理學研究新進展[J].中藥材，2004，27(1):70-72.