Smad4在腫瘤中的研究進展

閆繼東

(河北省唐山市工人醫院胸外科 河北唐山 063000)

1 Smad4的發現和鑒定

人類第18號染色體長臂區域上的等位基因雜合性缺失是多種腫瘤的頻發事件，迄今在這一區域已經發現和鑒定了多個腫瘤抑制基因，如DCC、MADR2/JV18-1、DPC4(Smad4)等。其中Smad4蛋白是TGF-β信號傳遞途徑的必需物質，處于中樞地位。1995年，有學者在研究黑腹果蠅Dpp體內信號的轉導時，發現DppI型受體細胞內信號的下游分子，并克隆其基因，這個基因被命名為Mad，隨后有學者克隆出Mad相關基因sma2、sma3、sma4，并認為其為mad同源物，在體內可以形成復合物并協同發揮作用。后來人們將各種mad相關蛋白統一命名為Smad，因此這類蛋白統稱為Smads蛋白。當前包括Smad1-9，它們都存在于細胞質中，作用是將TGF-β/Smads信號轉導入核內并參與TGF-β靶基因的調節。

Smad4作為Smads蛋白家族的重要成員，其基因定位于染色體18q21.1，含有11個外顯子，10個內含子，其核苷酸序列保存在GenBank的U44378中，基因的轉錄子長2680bp，是編碼552個氨基酸殘基組成的蛋白質。Smad4蛋白是通過研究多重終止密碼子和啟動子拼接位點而確定的。Smad4的一級結構分為3個區:N端區、C端區和中間連接區。N端區和C端區與其他動物的MAD蛋白高度同源，因此也稱MH1和MH2，中間連接區富含脯氨酸。Smad4與其它的Smad不同，其MH2沒有磷酸化結構SSXS，單獨存在不足以行使信號傳導功能，必須有部分中間連接區才能傳遞信號，這部分稱為Smad4的活性區。Smad4被認為是通用調節分子，因為它幾乎能與所有活化的受體調節型Smads蛋白結合，并形成低聚體復合物，參與信號轉導。

2 Smad4蛋白的功能及作用機理

Smad4蛋白與TGF-β密切相關，是TGF-β受體信號傳導途徑的重要成員。TGF-β是一種多功能多肽，在組織的發育、再生及修復中起重要作用;TGF-β還是一種具有多功能活性的細胞因子，其可以調節細胞增殖、分化和凋亡，對多種細胞因子有重要影響。TGF-β有兩型受體，每一型均含有細胞內有絲氨酸/蘇氨酸激酶區。TGF-β細胞因子信號傳導通過TGF-β I型、II型受體完成，這兩種受體都有一跨膜片斷，外端暴露于細胞外，內端插在胞漿中。它們也是絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過活化受體的磷酸化，從而使受體調節型Smad也活化。活化的受體調節型Smad協同Smad將受體信號傳到核內。許多Smad基因都介導了TGF-β超家族的功能，包括骨形成蛋白、活化素和TGF-β。Smad4在腫瘤中發病中，常常突變，突變類型以點突變為主，還可以有錯義突變、無義突變、移碼突變等，突變后的Smad4蛋白構象發生改變，不能與磷酸化的Smad2和Smad3結合，從而不能發揮調控轉錄的作用。Smad4的MH1域突變并不影響其本身的活性，但突變型的Smad4比野生型的更容易被激活泛素連接酶降解。磷酸化的TGF-β被激活后，可活化Smads蛋白，主要是Smad4，進而調節靶基因的轉錄，控制腫瘤細胞生長、分化及凋亡。此通路受細胞因子調節，其任何一個元件失調，均可引起細胞增生，而在腫瘤細胞形成過程中可引起分化異常，進而引起異常腫瘤性增生。體內細胞分泌的TGF-β主要通過調控核內CKI(細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子)的表達，阻止細胞周期運行，抑制細胞向惡性轉化。在信號傳導過程中，活化的TGF-β1與其膜返體結合后形成兩種異二聚體復合物，繼而磷酸化下游的Smad2，Smad3蛋白，磷酸化后的Smad2和Smad3可與Smad4形成異源復合物，由胞漿移位至胞核，調節靶基因的轉錄。有觀點認為Smads家族的基它成員也參與到此通路中，并形成正反饋與負反饋的平衡，共同調節腫瘤的進展。但是有觀點認為TGF-β在腫瘤的發生、發展中是一把“雙刃劍”，即在癌變期之初作為抑癌因子出現，而在癌癥晚期則通過自分泌(作用于癌細胞本身)和旁分泌(作用于癌細胞周圍的微環境)方式刺激腫瘤浸潤、轉移，因此，Smads與TGF-β的通路作用可能更為復雜。

3 Smad4在腫瘤中的作用

Smad4研究最多是在胰腺組織中，Smad4在胰腺癌組織中的表達明顯低于正常組織，同時相關研究表明胰腺癌中Smad4/TGF-β通路與PTEN和NF-kappaB調節有關。還有觀點認為胰腺癌中SCF(beta-TrCP1)對Smad4蛋白有重要的調節作用。范振斌等通過對30例移行細胞癌新鮮癌組織進行分析和精細遺傳作圖，并用DPC4/Smad4抗體對相應的病理組織切進行免疫組織化學分析，結果顯示DPC4/Smad4三個緊密聯鎖的微衛星位點D18S46、D18S363、D18S474有高頻率的雜合性缺失，18個微衛星位點中有5個點在所分析人群中多態性甚低，與西方人數據差別明顯;且免疫組化顯示DPC4/Smad4在80%的腫瘤中表達下降或不表達，與微衛星雜合性缺失對應良好，并認為抑癌基因DPC4/Smad4的失活在中國人膀胱移行細胞癌的發生發展中具有一定作用，其等位基因的雜合性缺失是該基因失活的重要機制。有觀點認為當RSmad被I型受體磷酸化，從而導致與CO-Smad Smad4結合，復合體進入核內啟動轉錄，一旦進入細胞核，Smad復合體與其他轉錄共刺激信號組成共抑制分子，共同控制靶基因的表達，因此伴隨著Wnt信號系統異常調節，或者由于Wnt基因的異常表達，破壞了正常的Wnt/B-catenin、Notch、BMP的信號系統，導致腫瘤細胞可自分泌大量的TGF-β1，磷酸化R-Smad，從而導致與CO-Smad Smad4結合，Smad4的減少，使細胞對TGF-β1的生長抑制產生耐受，促進腫瘤的發展。伴隨著Notch信號途徑的異常表達，引起下游級聯信號系統TGF-β超家族在內的細胞信號傳導的異常，Smad4作為TGF-β1信號傳導系統的關鍵組成元件，對其信號轉導具有著關鍵作用。其缺失或突變可使細胞對TGF-β1的生長抑制產生耐受，促進腫瘤的發展。體外細胞培養的實驗也證實了此觀點。有研究結果顯示Smad4與CyclinD1在膀胱癌中具有正相關性，且隨著腫瘤惡性程度的增高，二者的表達率均下降，認為Smad4與CyclinD1的表達與自然病程密切相關，其表達變化是腫瘤進展的表現。張磊等通過應用免疫組織化學技術檢測多Smad4、CyclinD1、Survivin和Cox-2在44例大腸癌組織中的表達，認為其聯合檢測對了解大腸癌的發生、發展、指導治療和判斷預后有重要意義，Smad4可作為一個獨立預測指標判斷大腸癌的預后。SELIL與Smad4蛋白在食管癌中具有協同作用，SELIL在食管癌中的作用可能通過TGF-β信號途徑影響基因的表達而調控細胞的生長。吳鵬等通過應用RNA干擾技術下調Smad4基因表達，觀察其對宮頸癌細胞增殖的影響，認為其能篩選出特異而高效阻斷Smad4基因表達功能的shRNA，Smad4基因表達下調能明顯促進宮頸癌細胞生長。Blackford等認為Smad4基因突變與胰腺癌的預后密切相關。Kloth等通過免疫組織化學技術對117例原發性宮頸癌患者的Smad4進行檢測，顯示腫瘤中Smad4低表達，并認為細胞漿中Smad4的弱表達和細胞核中表達的缺失與宮頸癌的不良預后密切相關。因此，Smad4在不同腫瘤中的表達均有變化，提示Smad4參與了腫瘤的發生發展。

4 Smad4在肺癌中的作用

有學者在1998年對肺癌組織及體外培養的細胞株中相關的Smad4/TGF-β基因進行分析，認為Smad4/TGF-β參與了腫瘤的發生。Gemma等通過Northern blot、RT-PCR等技術對肺癌細胞系TGF-β的表達進行分析，認為TGF-β可以調節MMP-2、PAI-1、IL-1及CEA等多種細胞因子，在肺癌的發生中具有至關重要的作用。Ke等認為Smad4通過不同的機制影響腫瘤的血管生成，并通過應用免疫組織化學技術檢測肺癌中DPC4/Smad4與血管生成的關系，結果顯示DPC4/Smad4能降低腫瘤組織中VEGF蛋白和mRNA的表達，增加TSP1蛋白和mRNA的表達，確認DPC4/Smad4是一個重要的生物學指標，并在腫瘤轉移及血管生成中發揮重要作用。Filyak等認為Smad2、Smad3、Smad4蛋白下調，而Smad7上調對人肺癌A549細胞系的發生發展有重要作用。Finger等認為TGF-βRIII作為一個新的腫瘤抑制基因在肺癌細胞系中普遍丟失，其表達可能與腫瘤的浸潤等生物學行為有關。因此，關于Smad4/TGF-β在肺癌及肺組織中表達，主要研究在體外培養的細胞系中，而對肺癌組織中蛋白的表達及mRNA的表達關注較少。

5 臨床意義和展望

目前關于Smad4在腫瘤中的研究是人們關注的熱點，其可以作為預測腫瘤預后的重要指標，因此，臨床可以借助相關的輔助方法來判斷患者預后。但是由于TGF-β超家族成員龐大，受體配體間組合作用多樣化，個體成員在不同腫瘤中發揮作用也不盡相同，因此對于其真正的作用機制及干擾因素，臨床及基礎研究中并不十分清楚，對其機理及影響因素的研究將是當前研究的重要方向。同時構建合格的人類腫瘤動物模型，進行阻斷Smad4/TGF-β通路的研究，有望成為腫瘤研究及治療的靶點，可以為腫瘤的治療提供新的思路。由于Smad4/TGF-β為腫瘤研究的新領域，與其它研究一樣，還有哪些基因可以誘導其強表達或弱表達？動物實驗中對Smad4/TGF-β的干擾能否直接用于臨床？Smads家族的其它成員，如Smad1、Smad2、Smad3、Smad7與Smad4/TGF-β是否具有相互作用？等等。相信隨著這些問題廣泛而深入的研究，對于抗腫瘤通路的研究及治療將開辟新的途徑。

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